酵母β-1,3-D-葡聚糖及其羧甲基衍生物的制备与免疫活性研究

摘要

以啤酒废酵母为原料，通过对自溶、酶解和碱溶等方法优化制备碱不溶性β-1,3-D-葡聚糖的工艺。结果表明：新鲜啤酒酵母泥经预处理、自溶、酶解、超声波破碎、1.0 mol/L NaOH溶液处理7.5h，脱水干燥后得到的碱不溶性β-1,3-D-葡聚糖呈乳白色，得率9.59﹪，其中糖含量91.91﹪，不含甘露聚糖，蛋白质含量为1.44﹪，碱不溶性葡聚糖中1→6键占29.92﹪。 为获得水溶性葡聚糖衍生物，对自制酵母碱不溶性β-1,3-D-葡聚糖进行羧甲基化改性。以取代度为指标，通过正交实验和加碱量的单因素实验，确定制备高取代度羧甲基葡聚糖条件为：羧甲基化反应时间4h，温度50°C，4.0 mol/L氯乙酸用量15ml。制备的CMG取代度达0.925，色泽纯白，完全水溶。 在体外实验中，以HL-7702、HepG-2、MGC-803为实验材料，通过MTT比色法分析比较β-1,3-D-葡聚糖及不同取代度的CMG对细胞生长的影响。结果显示：β-1,3-D-葡聚糖对HL-7702、HepG-2、MGC-803的生长无显著影响；CMG对HL-7702的生长影响较小，但对HepG-2 和MGC-803的抑制作用明显，并且随浓度升高各种取代度的CMG对HepG-2、MGC-803的抑制作用也随之增强，尤以取代度为0.556 的CMG2最为显著。CMG2浓度达到500μg/ml时对HepG-2的生长抑制率为54.3﹪，浓度为1000μg/ml时对MGC-803抑制率达到51.3﹪，认为在体外实验中取代度0.556左右的CMG具有有效的抗肿瘤活性。 在体内实验中，以华贵栉孔扇贝和养殖大黄鱼为研究对象，分别注射Glu和不同取代度的CMG，通过测定血清蛋白含量、血清和血细胞酚氧化酶(PO)比活力、超氧化物歧化酶(SOD)比活力和溶菌酶(LSZ)比活力四项免疫指标，综合比较β-1,3-D-葡聚糖和不同取代度的CMG对扇贝和大黄鱼的免疫刺激活性。结果显示： 1）CMG4(DS=0.857)可以显著提高扇贝PO、SOD和LSZ活力，且药效发挥时间较长；在取代度DS 0.857的条件下，CMG随着取代度的增加对扇贝免疫酶活的影响越显著。 2）5mg/g剂量的β-1,3-D-葡聚糖可以迅速提高大黄鱼血清蛋白含量和PO酶活水平以及血细胞中SOD酶活水平，但持续时间较短； CMG3(DS＝0.732)可以持续显著提高大黄鱼体内PO和SOD活力，对大黄鱼LSZ活力的影响较β-1,3-D-葡聚糖和其它的CMG显著；β-1,3-D-葡聚糖和CMG(CMG3除外)对大黄鱼血清和血细胞中的溶菌酶活力无显著影响；CMG取代度的提高有可能在一定程度上提高葡聚糖的免疫活性，但是并非取代度越高，其免疫活性越高，过多的羧甲基基团的引入很可能抑制CMG与细胞膜受体的结合，羧甲基取代度的差异对大黄鱼免疫酶活的影响较显著。 3）综合比较Glu和不同取代度的CMG对华贵栉孔扇贝和大黄鱼的免疫刺激作用，认为取代度0.70～0.80的CMG具有显著、持续稳定的免疫刺激活性，Glu对机体免疫酶活的刺激作用快速而短暂。