新型磁性蛋白质印迹材料用于重大疾病早期筛查的分析方法研究

摘要

本论文制备了一系列用于模拟生物探针的蛋白质印迹材料，在此基础上结合夹心免疫分析方法，开发了多种低成本、简单、高灵敏、高特异性的电化学发光(ECL)免疫分析方法；实现了对多种重大疾病诊断相关标志物(血红蛋白，HIV-1抗体，癌胚抗原CEA和糖类抗原CA199)的高灵敏痕量检测。具体如下：血红蛋白分析方法的构建是基于磁性分子印迹聚合物(MMIPs)模拟血红蛋白抗体，去除模板蛋白质后，实现对痕量模板蛋白质的富集和分离，通过构建的单抗体夹心ECL免疫传感器实现其超灵敏的检测，有望用于对心血管疾病的早期筛查。HIV-1抗体分析方法的构建是基于抗原决定基印迹技术，利用与HIV-1抗体具有相同Fc区的人免疫球蛋白(HIgG)作为模板分子合成MMIPs，去除模板蛋白后实现对血清中痕量HIV-1抗体的富集和分离，进而与HRP酶标记的HIV抗原发生夹心免疫反应，生成的免疫复合物可催化鲁米诺-双氧水体系的ECL，由此构建的ECL免疫传感器，有望用于艾滋病的早期筛查。癌胚抗原CEA和糖类抗原CA199的近同时分析方法是基于空间分辨技术，在两个工作电极上电聚合多巴胺分子印迹膜，通过构成的ECL免疫传感器实现两种肿瘤标志物的近同时分析，有望用于癌症的早期筛查。上述分析方法大大降低了实验成本，简化了实验步骤，增强了检测灵敏度，并且解决了蛋白质印迹材料结合待测物特异性受限的问题，为临床医学中重大疾病的早期筛查提供了技术支持。
　　本论文主要从下述方面开展研究工作：
　　1.基于蛋白质磁性分子印迹聚合物模拟捕获探针的单抗夹心电化学发光免疫传感器
　　本章采用血红蛋白作为模板分子，制备了代替一抗作为捕获探针的MMIPs，以及作为信号标签的Au纳米粒子包覆的Ru(bpy)32+掺杂的二氧化硅(Ru@SiO2@Au)纳米复合物，进而构建了一种基于分子印迹-抗体标记探针夹心反应策略的ECL免疫传感器，可用于痕量血红蛋白检测。用MMIPs作为捕获探针有助于大批量制备，极大地降低了成本，并提高了免疫传感器的稳定性。此外，磁性分离可大大简化制备过程，传感器可再生使用。再者，MMIPs能富集样液中超痕量的抗原，从而实现对血红蛋白的超灵敏分析。得到的血红蛋白线性范围为0.1~4×104pg mL?1，检测限为0.023 pg mL?1。与其它免疫传感器相比，该方法具有低成本，高灵敏度和高稳定性的优势，因此为临床蛋白质的快速超灵敏检测提供了解决方案。
　　2.用磁性分子印迹聚合物作为捕获探针超灵敏检测 HIV-1抗体的低成本电化学发光夹心免疫传感器
　　本章通过抗原决定基印迹技术，用人免疫球蛋白HIgG(与人免疫缺陷病毒-1抗体anti-HIV-1具有相同的Fc区但不同的Fab区)作为模板分子制备了MMIPs。以MMIPs作为捕获探针并用辣根过氧化物酶标记的抗原(HRP-HIV-1)作为信号标签，构建了一种快速和低成本的超灵敏检测anti-HIV-1的ECL夹心免疫传感器。首先，间氨基苯硼酸(APBA)被用作功能单体和交联剂，在模板分子HIgG存在下，加入引发剂过硫酸铵后，APBA在Fe3O4@SiO2 NPs表面聚合，由此获得了MMIPs。洗脱模板后MMIPs被用来识别和富集不同浓度的anti-HIV-1，再通过免疫反应结合HRP-HIV-1，形成夹心型免疫复合物，由此构建了一种新型的ECL夹心免疫传感器。通过固定在HRP-HIV-1上的HRP对Luminol-H2O2体系的ECL催化作用，anti-HIV-1稀释比例(标准阳性血清)在1:20,000~1:50范围内呈现线性响应，检测限为1:60,000(S/N=3)。该研发的方法为感染HIV病人的早期诊断提供了一种低成本，简单和灵敏的方式。
　　3.基于空间分辨技术近同时检测癌胚抗原和糖类抗原199的新型分子印迹电化学发光夹心免疫传感器阵列
　　本章制备了一种新型的含2个包覆分子印迹聚合物的丝网印刷碳工作电极，进而构建ECL夹心免疫传感器阵列，通过该阵列实现了肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)和糖类抗原199(CA199)的近同时免疫分析。将用作不同抗原(模板分子)功能单体的多巴胺与模板分子在丝网印刷电极的2个碳工作电极表面上电聚合，形成分子印迹聚多巴胺膜。利用它作为捕获探针，并用聚赖氨酸(PLL)与Au纳米粒子包覆的Ru(bpy)32+掺杂的二氧化硅(Ru@Si@PLL-Au)纳米复合物作为信号标签。构建的免疫传感器阵列的ECL信号借助自制的单刀双掷开关，由光电倍增管(PMT)近同时测得。得到的对CEA和CA199浓度的线性范围分别为0.05~100 pgmL-1和0.03~80 pgmL-1，检测限分别为0.02和0.01pgmL-1。该新型的ECL免疫方法将空间分辨技术与分子印迹技术结合起来，为CEA和CA199的复合免疫分析提供了一种简单，低成本，快速和灵敏的途径。

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引言

1文献综述

1.1电致化学发光

1.2磁性分子印迹技术

1.3多组分同时分析在生物免疫传感器中的应用

1.4本论文的创新点与基本思路

2基于蛋白质磁性分子印迹聚合物模拟捕获探针的单抗夹心电化学发光免疫传感器

2.1引 言

2.2实验

2.3结果与讨论

2.4本章小结

3用磁性分子印迹聚合物作为捕获探针超灵敏检测 HIV-1 抗体的低成本电化学发光夹心免疫传感器

3.1引 言

3.2实验

3.3结果与讨论

3.4本章小结

4基于空间分辨技术近同时检测癌胚抗原和糖类抗原 199 的新型分子印迹电化学发光夹心免疫传感器阵列

4.1引 言

4.2实验

4.3结果与讨论

4.4本章小结

5全文总结

参考文献

在 学 研 究 成 果

致谢