银杏叶提取物诱导大鼠主动脉平滑肌细胞中血红素氧合酶-1表达的分子机制研究

摘要

目的：复苏传代培养大鼠主动脉平滑肌细胞(Smooth muscle cell，SMC)，研究不同浓度的银杏叶提取物(Extract of gingko biloba，EGb)孵育诱导大鼠主动脉SMC中血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)表达的量效关系(诱导组实验)，并初步探索EGb诱导HO-1表达的分子机制(阻断组实验)。 方法： 1．细胞培养(cell culture)：配置好细胞培养所需的各种液体后，复苏大鼠主动脉SMC细胞株第3代(Passage 3，P3)，24h后可见SMC贴壁说明复苏成功，继续传代培养至第6代(P6)。 2．预处理：当SMC生长密度达到80％左右时对其进行预处理，即使用含1％胎牛血清的培养基孵育24h，使细胞生长同步化。 3．EGb诱导实验：(1)实验分组：将25瓶SMC随机分为5组，每组5瓶，用不含胎牛血清的培养基孵育。(2)同时用微量加样器将EGb分别加入这5组SMC中，使其浓度分别达到0、50、100、200、400μg/ml，在孵箱中孵育8h。 4．裂解细胞提取蛋白：在每瓶SMC中加入细胞裂解液300μl，置于冰上经振荡器充分振荡裂解1h，高速低温离心机中离心取上清蛋白。 5．蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HO-1蛋白：BCA法测蛋白含量、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、考马斯亮蓝染色观察蛋白条带、电转移(electrotransfer)、封闭PVDF膜、免疫反应(加入一抗即小鼠抗大鼠HO-1单克隆抗体和二抗即辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体)、ECL法免疫荧光显像。 6．图像分析：将Western blot结果扫描传送至计算机，用Image-Pro Plus图像分析软件系统对HO-1条带进行分析，以HO-1条带灰度值代表HO-1的表达量，分析HO-1的表达水平和EGb的最适浓度。 7．放线菌素D(Actinomycin D，ActD)阻断实验：再次培养5组大鼠主动脉SMC第6代，每组5瓶，预处理后用无血清培养基孵育的同时按A-E组进行实验分组后孵育。A组：Blank control(空白对照组)8h；B组：EGb最适浓度8h；C组：DMSO 5μl(溶剂)8h；D组：ActD 4＃m(DMSO 5μl)8h；E组：ActD 4μm(DMSO 5μl)30min，再加入最适浓度的EGb共同孵育8h(dimethyl sulfoxide，DMSO，二甲亚砜)，再次采用Western blot法分析HO-1条带变化。8．统计学分析：组间差异先用单因素方差分析，再用q检验进行两两比较。 结果： 1．细胞形态学： (1)复苏后的SMC贴壁生长后以梭形为主，部分呈多角形和带状，单核、核大，逐渐呈集落状分布趋势。生长6-7d后，SMC不断增多，互相融合，密集排列呈漩涡状、峰谷状或平行状。 (2)预处理前后和诱导前后比较看来，SMC形态未见明显变化，但由于胎牛血清浓度下降，细胞生长速度较之前变慢。 2．EGb诱导实验组：(1)电泳条带分析：空白对照组中HO-1有微量基础表达，显影最浅；EGb诱导大鼠主动脉SMC的HO-1蛋白电泳条带显影随EGb浓度增加(50、100、200μg/ml)而加深，并且在EGb浓度为200μg/ml时蛋白电泳条带显影最深，在400μg/ml时显影反而转浅。(2)灰度值分析：随EGb浓度的增加，HO-1表达增加，各组之间差异明显(P＜0.01)；在EGb浓度200μg/ml孵育8h的情况下HO-1的表达达到峰值，随后HO-1的表达有所下降。 3.ActD阻断实验组： (1)电泳条带分析：A-E组中条带显影程度各有不同，从条带深浅上看由浅到深依次为D、A和C(大致相同)、E、B。 (2)灰度值分析：灰度值大小和肉眼所见显影程度一致，其中除了A组和C组之间的差异没有统计学意义之外(P＞0.05)，其余各组之间差异显著(P＜0.01)。A组为空白对照组，HO-1有一定基础表达；B组为最适浓度200μg/ml的EGb诱导，HO-1的灰度值为最大；C组与A组HO-1灰度值差异不大，提示溶剂DMSO对HO-1的表达几乎是没有影响的；D组与A组HO-1灰度值差异显著，提示ActD对HO-1的基础表达就已经有抑制作用； E组与B组HO-1灰度值差异显著，提示ActD对EGb诱导的SMC中HO-1表达具有阻断作用。 结论： 1．EGb可以诱导大鼠主动脉SMC中HO-1表达，并且这种表达具有量效关系，即随EGb浓度增加HO-1蛋白表达增加，且在EGb浓度达200μg/ml时HO-1蛋白表达达到峰值，随后呈下降趋势。 2．分子表达机制研究显示，EGb诱导HO-1表达依赖于基因转录途径。

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血红素氧合酶-1与心血管疾病研究