一种改良的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的分离制备方法

摘要

本发明公开了一种改良的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的分离制备方法。包括如下主要步骤：1)以复合酶短暂消化去除大鼠胸主动脉血管的内、外膜层，保证中膜层的完整性；2)以一小时的复合酶消化释放、分散和制备胸主动脉VSMC；3)获得高产量、活力佳、可传代的收缩型大鼠胸主动脉VSMC。本发明方法所分离的胸主动脉VSMC活性高、纯度好；分离步骤简单、耗时短、成功率高，适用于初学者的操作。

说明书

技术领域

本发明涉及生物、医药学等领域，具体涉及一种改良的、收缩型大鼠胸主 动脉血管平滑肌细胞的高效制备方法。

背景技术

正常生理状态下的血管平滑肌细胞(VSMC)呈收缩表型，当细胞从收缩 型向合成型转变后，其增殖加快、迁移变强、并向内膜层生长，使得血管管壁 加厚、管腔变窄，血流阻力增高，导致高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的 发生。VSMC如何维持其收缩型表型、病理状态下的异常表型如何发生和转变， 这些机理问题的阐述不仅有助于我们了解心血管疾病发病机理，更是研发各类 心血管疾病防治手段的基础。鉴于VSMC在心血管疾病研治中的特殊作用，如 何高效、简便地制备活性好、纯度高的VSMC，成为目前首要任务。

目前，分离培养VSMC的方法主要有组织块贴壁法和酶消化法。前者以器 械机械剥离外膜、刮除内膜、将血管剪成1mm²的小块置于培养瓶中进行贴壁 培养。该方法对操作技巧要求高，剥离外膜时易有残留，刮除内膜时用力过小 会有内皮细胞残留、用力过度则易刮伤中膜层。因此，初学者采用此方法进行 VSMC分离时，经常有组织块漂浮、细胞培养时间过长的问题。酶消化法则是 采用蛋白酶对剔除干净周围组织的血管进行直接消化来分离VSMC。先后有人 采用胶原酶、胰酶单一消化或者二酶复合消化进行VSMC分离的成功报道，但 是胶原酶消化时间过长6～12小时不等，而胰酶对VSMC有较强的损害，消化 时间不易掌握，容易消化不均匀导致对平滑肌细胞损伤较大，不易得到活性好、 数量多的平滑肌细胞。也有人联合酶消化法和组织块贴壁法，先机械剥离外膜 再进行酶消化。但是仍然存在过度牵拉中膜层、过长的酶消化等损伤平滑肌细 胞等问题。

为克服现有技术的不足之处，我们综合了国内外VSMC成功分离的经验， 对酶消化法进行了有效的改良。采用复合酶“二步法”，先消化内外膜，避免 了去除内外膜时对中膜层产生的机械拉伤；随后再消化中膜层以释放并分离 VSMC。该改良方法操作简单、分离效果重复性好，获得的VSMC的数量和质 量高、活力和纯度好，特别适用于VSMC分离的初学者。

发明内容

鉴于现有技术的以上不足，本发明提出一种改良的简便高效的收缩型大鼠 胸主动脉VSMC的分离方法，使所获得的收缩型VSMC的纯度高、活力好，可 在体外进行传代培养。

本发明目的的实现手段如下：一种收缩型大鼠胸主动脉VSMC的体外分离 制备方法，通过二步复合酶消化释放大鼠胸主动脉VSMC和细胞悬液制备大鼠 胸主动脉收缩型血管平滑肌细胞,包括如下步骤

1)取乙醚麻醉大鼠，迅速剪取其胸主动脉；

2)反复冲洗胸主动脉，去掉其表面粘附的凝血等组织块；

3)剔净血管的周围组织，然后放入复合酶液中、在37℃的气浴恒温振荡 器里消化45分钟，随后剥离血管外膜层、刮除内膜层和剥离中膜层；

4)以含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS漂洗分离的中膜层，置于干净的培养皿进行 快速剪碎(1-2mm³)，然后转入放有复合酶液的6孔板内、并于孵箱中37℃、 5％CO₂，消化1小时；

5)终止消化，用10ml的注射器抽打组织消化液直至细胞基本从组织残片 中脱离，再用细胞筛过滤获得悬液；取滤网上的组织，重复抽打和过滤，将多 次过滤后的细胞悬液一起转移到15ml的离心管里，1000转/分、离心5分钟收 集细胞；

6)取含20％FBS的DMEM悬浮细胞，种入6孔板进行培养。

在实施过程中，其中所述步骤1)中的胸主动脉为新鲜采集的活体胸主动 脉，取出后置于1-4℃的容器中。

其中所述步骤2)中的清洗液为高压灭菌的PBS或者高压灭菌的生理盐水， 器具为2ml的注射器。

其中所述步骤3)中的复合酶配方为二型胶原酶1mg，胰蛋白酶抑制剂1mg， 胰肽酶7.08μl，最后用含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS定容为1ml。平均一段大鼠胸主 动脉需1ml复合酶。

其中所述步骤3)中消化时间为45-50分钟，随胸主动脉的大小和酶液活 性变化略加变动。当消化过程中观察到血管变透明、周围组织成絮状可终止消 化。

其中所述步骤3)中剥离外膜和刮除内膜均在预冷的不含血清的带双抗的 DMEM中进行。

其中所述步骤4)中的复合酶的配制和使用量同步骤3)。

其中所述步骤4)中消化在细胞培养箱中进行，时间为1小时左右，每20 分钟取出轻微晃动。消化50分钟后一般可观察到有大量细胞在组织块表面呈 葡萄状暴露并开始游离出来。这时终止消化。

其中所述步骤5)中终止消化用含20％FBS、1％P/S的DMEM培养基。

其中所述步骤5)中细胞筛孔径为40μm。

其中所述步骤6)中细胞种植密度为1条主动脉/1个孔(6孔板)，在37℃、 5％CO₂培养箱内培养。

依本发明所分离培养的大鼠胸主动脉VSMC在镜下观察呈梭形、长条形和 三角形，纯度超过95％。

比较本发明提供的大鼠胸主动脉VSMC分离培养方法与传统的组织块贴壁 法，可发现由于去除外膜的操作温和简便，避免了机械除膜时对中膜层的平滑 肌细胞的刮伤，且避免了外膜残留、降低了其污染。与传统的单一酶消化法相 比，本发明可显著缩短消化时间，便于保持细胞活性。而且本方法消化时间较 稳定、消化较为均匀有效，确保细胞产量。和传统的复合酶消化法相比，本发 明提供的复合酶的配制和使用操作不仅消化效果较好，而且步骤简捷、污染少。 因此，本发明成功地摸索出一种操作简便、高效、重复性好的VSMC分离培养 方法，可获得纯度好、活性佳、具有显著收缩型性状的VSMC。

附图说明

图1为大鼠胸主动脉VSMC的分离和培养结果图。其中，A为酶消化接近 完成时细胞开始在组织块表面裸露出来时的形态；B为所分离的VSMC刚接种 在6孔板中的形态；C为接种的VSMC静置48小时后开始贴壁的形态；D为第 八天VSMC细胞呈峰谷状的生长形态。

图2为以CCK-8检测分离的VSMC在体外培养中的增殖结果图。

图3为所分离的VSMC细胞中各收缩型VSMC的表型基因mRNA表达水平 的分析结果图。其中，A图为定量PCR分析的结果图，B为扩增产物在2％的琼 脂糖凝胶上的电泳结果图。

图4为所分离的VSMC细胞中收缩型VSMC的各表型蛋白表达水平的分析 结果图。

图5为基因对应的特异引物序列表。

具体实施方式

为了使发明的目的、技术方案和优点更加清晰，下面结合附图对本发明作 进一步的描述。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本 发明。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段，实施例中化学试剂除特别说明外，均为市售。

实施例1原代大鼠胸主动脉VSMC的分离试验：

复合酶液配方：二型胶原酶1mg/ml(WorthingtonBiochemical Corporation,44N15309A,USA)，胰蛋白酶抑制剂1mg/ml(Worthington BiochemicalCorporation,R4H15000,USA)，胰肽酶7.08μl/ml(Worthington BiochemicalCorporation,35M16094,USA)，以含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS为溶剂， 定容为1ml；每条大鼠胸主动脉平均每次取1ml复合酶进行消化。

本实施例所用大鼠胸主动脉为体重90-120g、健康的SPF级别的SD大鼠。 取乙醚进行动物麻醉，转至无菌手术台，将动物腹腔向上固定。先用75％的酒 精喷湿大鼠胸腹部位置，依次剖开腹部、胸腔，取棉签拨开内脏，暴露出胸主 动脉血管；再以眼科剪小心剔除粘附在血管外表面上的组织和粘膜，然后迅速 剪取胸主动脉，置于高压灭菌、预冷的0.9％氯化钠生理盐水中，立即转移到 超净工作台进行后续操作。

随后在操净台内，先用高压灭菌、预冷的生理盐水反复冲洗血管表面的血 污；再用2ml的注射器吸取生理盐水进一步冲洗管腔内的凝血块等，直至没有 血色物质被冲洗出来(3次左右)；然后小心剔净血管表面黏附的纤维组织， 注意不要伤害血管，准备进行第一次酶消化。

分装出1ml37℃预温的酶液，置于4ml的微量离心管(EP)管里。将上述 处理干净的血管在HBSS液中略微漂洗，放入复合酶液中，在37℃的气预恒温 振荡器里进行消化45分钟，摇速60转/分。该步消化结束后可见动脉血管趋 透明、表面粘附组织呈絮状。小心取出消化后的血管，放在预冷的带双抗的 DMEM中，使用弯头、直头眼科镊将整个外膜类似袜子一般剥离。漂洗余下的 血管，用弯头的小剪刀沿纵向剪开血管；以弯头小镊轻轻刮除内膜2-4次，最 后以含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS漂洗剥离的中膜。

将剥离的中膜置于干净的培养皿，以弯头眼科剪快速剪成1-2mm³小块，转 入一个放有1ml复合酶液的6孔板，迅速转移到孵箱中，37℃，5％CO₂，消化 1小时；消化时每20分钟轻轻晃动孔板；消化50分钟以后开始借助显微镜观 察细胞从组织块游离的情形。可以观察到组织块表面上细胞逐渐呈葡萄状显出， 在边缘部分的细胞开始脱离组织纤维束缚、呈窜珠状游离，少量细胞已经完全 游离于消化液中。

待多数组织块中的细胞开始脱落时，加入预热过的含20％血清的DMEM培 养基3ml终止消化。用10ml注射器(1.2x30TWLB)抽打组织消化液帮助细胞 进一步从组织残片中的脱离(大致10-20次)。随后用40μm的细胞筛过滤悬 液到6孔板的另一个孔内。取滤网上的残留组织块，重复抽打和过滤1次，和 第一次的细胞悬液一起转移到15ml的离心管里，1000转/分离心5分钟收集 细胞。最后以含20％FBS和1％双抗的DMEM重新悬浮细胞，种入1个6孔板内 并放置于孵箱进行培养，37℃、5％CO₂。静置培养48小时后开始观察细胞。

实施例2原代大鼠胸主动脉平滑肌的培养试验：

新鲜分离的P0代VSMC悬浮于含20％FBS、1％双抗的DMEM中，于孵箱里静 止培养2天，37℃，5％CO₂。48小时后观察，发现细胞已贴壁并开始铺展；更 换新的含20％FBS、1％双抗的DMEM培养基接着培养7天左右，P0代细胞可长满 单个6孔板培养孔，传代于一个10cm培养皿(P1代)；再过7天左右P1代细 胞可长满培养皿，传代于2-3个10cm培养皿(P2代)。P2代细胞长满后开始 进行冻存。P0-2代VSMC均以含20％FBS、1％双抗的DMEM培养，P3代以后的VSMC 则以含10％FBS、1％双抗的F-12/DMEM(1：1)进行培养。

实施例3原代大鼠胸主动脉平滑肌的传代：

当VSMC汇合度达到80-90％即可传代。以P0代VSMC为例，将6孔板内的 培养液吸出，加入1mlPBS液漂洗细胞以除去残留的血清和死细胞。加入适量 的0.25％胰蛋白酶液，轻轻摇晃，放在37℃孵箱消化大约10s-20s，可在倒置 相差显微镜下观察到细胞开始收缩成圆形、细胞之间的连接明显消失并出现明 显空隙。这时加入含血清培养基终止胰酶消化。用吸管温和吹打细胞制成单细 胞悬浮液，在倒置相差显微镜下观察细胞吹打情形。将单细胞悬液移入15ml 离心管内进行离心1000转/分，5分钟。吸弃上清，加入4ml培养基重悬细胞 沉淀。把单细胞悬液分装于一个新的10cm培养皿里，补加适量培养基，48小 时后换液，除去死细胞和未贴壁的细胞。对P0～4代VSMC观察发现，传代后细 胞有少量死亡现象，但多数细胞迅速贴壁、形态正常，维持很好的生长速度。

实施例4原代大鼠胸主动脉平滑肌的冻存及复苏试验：

P2代VSMC细胞在计划冻存前先以新鲜的完全培养基培养3-6小时，同时 配制P2代VSMC冻存液：50％DMEM+40％FBS+双抗+10％DMSO，4℃预冷备用。 参照传代操作步骤对细胞进行消化收集后，用预冷的冻存液缓慢的重悬细胞至 浓度约为0.5×10⁶/ml，转入冻存管。将冻存管放置在细胞冻存盒内，再置于 ﹣80℃冰箱，16-18小时后转移至液氮中长期保存。

P3代以后的VSMC细胞在计划冻存前先以新鲜的完全培养基培养3-6小时， 同时配制P3代VSMC冻存液：70％DMEM-F12(1:1)+20％FBS+双抗+10％DMSO， 4℃预冷备用。参照传代操作步骤对细胞进行消化收集后，用预冷的冻存液缓 慢的重悬细胞至浓度约为0.5×10⁶/ml，转入冻存管。将冻存管放置在细胞冻 存盒内，再置于﹣80℃冰箱，16-18小时后转移至液氮中长期保存。

复苏：从液氮罐中取出VSMC冻存管，立即置于37℃水浴锅中，快速振 动使细胞在1分钟之内融化。将解融的细胞悬液缓慢滴入盛有5ml完全培养基 的离心管中，室温(800转/分)离心5分钟。收集细胞沉淀以10ml完全培养 基重悬细胞，温和吹打成单细胞悬液，转移至10cm培养皿中进行常规细胞培 养。4小时后可观察到95％以上细胞贴壁，形状饱满、生长状态好，表明本发 明所分离培养的胸主动脉VSMC经冻存、复苏后可正常生长、维持良好的形态 和稳定的生长态势，可继续应用于后期各项实验中。

实施例5CCK-8测定原代大鼠胸主动脉VSMC细胞的增殖活力：

取P2代平滑肌细胞，每孔约700个细胞等量接种于96孔板中，每孔加入 100μl的20％DMEM培养基，置于5％CO₂、37℃孵箱进行培养取不同培养时间点 的细胞，每孔加入10μl的CCK-8试剂混匀，放回5％CO₂、37℃孵箱中孵育1 小时。取出后采用酶标仪在450nm波长处测定各孔的光密度值，得到每孔的相 对活细胞量。从图二中可看到，细胞刚贴壁时增长较缓慢，经过3天后开始呈 现对数期增长，表现出较高的活力和增殖能力。

实施例6原代大鼠胸主动脉VSMC的基因表达分析：

以Trizol试剂(Invitrogen)分别裂解2次制备的P2代VSMC和大鼠肝 星状细胞株T6细胞，提取总RNA；随后以反转录试剂盒(Thermofisher)制 备cDNA第一链，再以定量PCR反应(BioRad)分析mRNA的表达水平(各基因 对应的特异引物序列见图5)。如图三A所示，两次分离的VSMC细胞均高水平 表达一系列收缩型SMC表型标记物基因，如α-Sma、Myh11、Sm22α等；控制 这些基因的主要调节转录因子Myocardin也在细胞中表达。较T6这种肌纤维 化样的肝型状细胞，分离的VSMC中α-Sma和Sm22α的表达水平明显增高，进 一步表明这些细胞维持很好的收缩型SMC的性状。如图三B，我们以2％的琼脂 糖凝胶电泳检测扩增产物，发现它们均为单一条带。该结果说明扩增的特异性。 以RIPA液(Sigma)分别裂解P2-4代VSMC、T6细胞及Hela细胞，制备细胞 总蛋白；以BCA蛋白测定试剂盒(BCA，Thermofisher)定量蛋白浓度后进行 SDS-PAGE电泳将蛋白按大小分离；随后以蛋白印迹将胶上的蛋白转移至PDVF 膜(BioRad)，用5％脱脂奶粉进行封闭，分别和α-Sma(AbCam)、Myh11(AbCam) 和β-Tublin蛋白抗体孵育杂交，定量检测这些蛋白的表达水平。如图四所示， 尽管所有的细胞都检测到相应的蛋白表达，分离的P2-4代VSMC中α-Sma和 Myh11的水平显著高于T6和Hela细胞；而且，我们在P2代VSMC中检测到较 P3和P4代VSMC有更多的β-Tublin蛋白。这些结果充分说明所分离的VSMC 在传至P4代时仍然维持极好的收缩型SMC性状。