Ang-(1-7)对TGF-β和CTGF诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质分泌的影响

摘要

目的：探讨血管紧张素—（1—7）[Ang—（1—7）]对转化生长因—β1（TGF—β1）和结缔组织生长因子（CTGF）诱导大鼠肾小球系膜细胞（GMCs）细胞增殖和细胞外基质分泌的影响。 方法：将GMCs传代培养后按以下分组加入不同干预因素，Ang—（1—7）终浓度为10—6mol/L，TGF—β1终浓度为5ng/ml，CTGF为终浓度5ng/ml。 ①对照组：GMCs培养液中不加入干预因素； ②Ang—（1—7）组：GMCs培养液中加入Ang—（1—7）； ③TGF—β1组：GMCs培养液中加入TGF—β1； ④TGF—β1+Ang—（1—7）组：GMCs培养液中加入TGF—β1及Ang—（1—7）； ⑤CTGF组：GMCs培养液中加入CTGF； ⑥CTGF+Ang—（1—7）组：GMCs培养液中加入CTGF及Ang—（1—7）。 （1）采用WST—1法检测肾小球系膜细胞数目：传代培养的GMCs用无血清的DMEM培养液制成5×104/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100μl，无血清培养24h后按上述分组加入药物，干预24h后，每孔加入WST—110μl，37℃继续孵育4h，在酶联免疫检测仪450nm波长处测定吸光光度（OD）值，OD值越大代表细胞数目越多； （2）RT—PCR法检测层粘蛋白（LN）mRNA和Ⅳ型胶原（ColⅣ）mRNA表达：实验分组及药物干预浓度同上，药物干预48h后，按RNA提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，逆转录为cDNA后进行PCR反应。PCR反应结束后取产物15μl于1.5%琼脂糖凝胶中以0.5×TBE作为电泳缓冲液，100V电压电泳40min，用凝胶成像扫描分析系统，测定各组目的基因与内参基因的光密度比值。 （3）放射免疫法检测细胞培养上清液中LN和ColⅣ的含量，观察GMCs细胞外基质分泌情况：实验分组及药物干预浓度同上，按实验分组加入不同药物干预48h后，用放射免疫法检测细胞培养上清液中LN和ColⅣ的含量。实验结果用均数士标准差（x±s）表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示有统计学意义。采用SPSS14.0软件进行统计学分析。 结果： （1）TGF—β1和CTGF明显诱导GMCs增殖（P<0.05）； Ang—（1—7）可明显抑制基础状态下的GMCs增殖（P<0.05）；同时Ang—（1—7）对TGF—β1和CTGF诱导的系膜细胞增殖有显著的抑制作用（P<0.05）。 （2）检测LNmRNA、ColⅣmRNA表达：与对照组相比，TGF—β1和CTGF可明显上调GMCs LNmRNA、ColⅣmRNA表达（P<0.05）； Ang—（1—7）明显下调基础状态下GMCs LNmRNA、ColⅣmRNA的表达（P<0.05）；Ang—（1—7）对TGF—β1和CTGF诱导的LNmRNA、ColⅣ mRNA的表达均有明显的抑制作用（P<0.05）。 （3）细胞外基质成分层粘蛋白（LN）和Ⅳ型胶原（ColⅣ）的含量：细胞上清液细胞外基质成分LN、ColⅣ含量在TGF—β1组较对照组明显升高（P<0.05），Ang—（1—7）组上述指标均低于对照组（P<0.05），同时Ang—（1—7）对TGF—β1和CTGF的促细胞外基质LN、ColⅣ分泌也有显著的抑制作用（P<0.05）。 结论： ①Ang—（1—7）能抑制基础状态下及TGF—β1、CTGF诱导的GMCs增殖。 ②Ang—（1—7）可下调基础状态下及TGF—β1、CTGF诱导的GMCs LN、ColⅣmRNA的表达。 ③Ang—（1—7）减少基础状态下及TGF—β1、CTGF诱导的GMCs细胞外基质LN、ColⅣ的分泌。

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FGF-β在肾脏纤维化中作用研究进展(综述)

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