病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ调控抗HIV-1基因APOBEC3G表达机制的初步探讨

摘要

目的：病毒巨噬细胞炎症蛋白II(vMIP-II)是由卡波氏肉瘤疱疹病毒(KSHV) K4基因编码的一种人趋化因子同源蛋白。载脂蛋白 B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)是具有抗HIV-1功能的天然免疫因子。已有研究报道和本课题组前期研究显示vMIP-II可上调APOBEC3G的表达，但其表达调控机制及信号通路尚不清楚。本研究在明确vMIP-II上调APOBEC3G的基础上，进一步探讨vMIP-II激活APOBEC3G表达的信号通路及调控其表达的关键启动子作用区域。
　　方法：通过脂质体转染方法将构建好的pEGFP-N3-K4真核表达载体转染入293T细胞中，以转染空载体pEGFP-N3细胞组为对照，Western blot技术检测转染pEGFP-N3-K4质粒细胞中vMIP-II的表达情况。采用定量PCR和Western blot技术分析vMIP-II对APOBEC3G以及趋化因子受体CCR3、CCR5、CCR6表达的影响。比较IFN-a与vMIP-II在诱导细胞中APOBEC3G表达水平的差异。检测AG490(JAK/STAT信号通路抑制剂)和U0126(ERK信号通路抑制剂)对细胞中APOBEC3G及JAK/STAT与ERK信号通路下游关键因子及其磷酸化表达水平影响，分析这些信号通路在vMIP-II激活细胞APOBEC3G表达中的作用。应用双荧光素酶报告基因检测系统分析vMIP-II调控APOBEC3G转录活性的关键启动子作用区域。
　　结果：⑴vMIP-II使APOBEC3G的mRNA和蛋白表达水平分别上调了2.6和1.7倍,1000IU IFN-α使空载体转染细胞组APOBEC3G的mRNA和蛋白表达分别上调1.8和2.0倍。统计学分析显示vMIP-II上调APOBEC3G的功能显著高于1000IU IFN-α(P<0.05)。⑵vMIP-II上调趋化因子受体CCR3、CCR5和CCR6的mRNA水平，CCR3及CCR6的蛋白表达水平，并上调ERK1/2、STAT1、STAT2、STAT3的蛋白和磷酸化水平。AG490抑制了pEGFP-N3-K4转染细胞中STAT1的表达水平和STAT2、STAT3及两者磷酸化表达水平；U0126抑制作用不显著。3.报告基因检测结果显示，pEGFP-N3-K4质粒转染组APOBEC3G启动子活性明显强于空质粒组，其启动子活性在翻译起始位点上游720bp处开始大幅度下降且再无增强。
　　结论：①真核表达载体pEGFP-N3-K4能在293T细胞中表达vMIP-II蛋白，且可上调APOBEC3G表达。②JAK/STAT信号通路在vMIP-II调控细胞内APOBEC3G表达机制中发挥着重要作用。③vMIP-II在转录水平上明显激活了APOBEC3G的启动子活性，其关键转录元件区域位于APOBEC3G翻译起始位点上游720bp到480bp之间（-720/-480）。

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引言

第一章 综述

1.1病毒巨噬细胞炎症蛋白- II

1.2 趋化因子受体

1.3 载脂蛋白B mRNA 编辑酶催化样蛋白3G(APOBEC3G）

1.4 vMIP-II可上调APOBEC3G表达

1.5小结与展望

第二章 材 料

2.1菌株、质粒和细胞株

2.2主要试剂

2.3主要仪器设备

2.4常用试剂配制

2.5 PCR引物

2.6 常用引物的稀释

第三章 方法

3.1细胞的复苏、培养、传代、冻存和计数

3.2转染

3.3 干扰素和抑制剂处理

3.4 western blot(蛋白质免疫印迹试验)

3.5 RNA的抽提

3.6 逆转录PCR

3.7 PCR验证待筛选目的基因是否表达

3.8 实时定量PCR

3.9双荧光素酶报告基因检测系统

第四章 结果

4.1 vMIP-II蛋白在293T细胞中的表达

4.2 vMIP-II上调APOBEC3G的表达

4.3 vMIP-II与IFN-a上调细胞内APOBEC3G表达的比较分析

4.4 vMIP-II对细胞膜表面趋化因子受体CCR3、CCR5、CCR6表达水平的影响

4.5 AG490(JAK/STAT信号通路抑制剂)和 U0126（ERK信号通路抑制剂）对APOBEC3G表达影响

4.6 AG490和U0126对趋化因子受体CCR3、CCR5、CCR6以及JAK/STAT信号通路和ERK信号通路下游关键分子因子蛋白水平影响

4.7 vMIP-II调控APOBEC3G转录活性的关键启动子作用区域

第五章 讨论

5.1 K4基因的选取

5.2 抗HIV免疫抑制因子APOBEC3G的选取

5.3 克隆载体的选取

5.4 抑制剂AG490和U0126的选取

5.5 vMIP-II能够上调APOBEC3G的表达

5.6 JAK/STAT信号通路抑制剂AG490和ERK信号通路抑制剂U0126对vMIP-II调控细胞内APOBEC3G表达的影响

5.7 vMIP-II上调APOBEC3G表达的关键启动子调控区域

结论

参考文献

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