p27KIP1对犬颈动脉支架置入后支架内再狭窄影响及Rho激酶抑制剂法舒地尔的干预研究

摘要

目的：1、观察比格犬通过球囊损伤结合氮气干燥比格犬颈动脉内皮细胞形成颈动脉粥样硬化狭窄模型;2、支架植入术后P27(KIP1)对再狭窄过程中新生内膜形成的作用,以及Rho激酶抑制剂法舒地尔的干预研究。方法:18只雄性比格犬,按照随机的原则分为假手术组(A组, n=4)、动脉粥样硬化狭窄造模组(E组,n=14,其中包含2只造模备用)。假手术组(A组)在分离出双侧颈总动脉后,不进行任何处理,然后缝合伤口,动脉粥样硬化狭窄造模组双侧颈总动脉均进行氮气加球囊损伤内皮细胞,造模后均给予高脂饮食2个月,造模2个月后在进行 DSA检查,并将 E组随机分为动脉粥样硬化狭窄组(B组),单纯支架组(C组),支架加药物治疗组(D)。在 C、D组比格犬右侧颈总动脉中植入支架,之后普通饮食喂养,在造模前、支架植入前3天和置入后7天,2个月分别行颈部血管彩超检查,观察颈总动脉斑块形成及狭窄情况,支架置入后2个月时再次行 DSA检查,了解颈部支架置入血管血流及有无充盈缺损情况。随后取比格犬双侧颈总动脉,将右侧颈总动脉用于病理形态学检测,以免疫组化法检测 P27(KIP1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、 a-平滑肌肌动蛋白。结果:1、在造模过程中有2只比格犬死亡,立即补上,在最后取血管标本的过程中,假手术组中有一只比格犬死亡,死亡原因可能均为麻醉意外所致,其余12只比格犬在取出双侧颈总动脉后,仍存活良好。
　　2、 HE染色示 A组(假手术组)无内膜增生; B组(动脉粥样硬化狭窄组)内膜增生明显,可见大量粥样硬化斑块、胆固醇结晶以及新生内膜;C组(单纯裸支架组)可看到支架内内膜膜增生明显,支架周围可见炎性细胞聚集;D(支架加药物治疗组),可见不同程度的新生内膜增生,支架周围炎症细胞聚集比较离散。
　　3、 P27(KIP1)免疫组化结果示A组(假手术组)中膜上可见较多棕黄色阳性颗粒,B组(动脉粥样硬化狭窄组)、C组(单纯支架组)中膜和内膜均可以看到棕黄色阳性颗粒表达较少;D(支架加药物治疗组)中层棕黄色阳性颗粒表达更多、染色更深,内膜部位表达较浅, P27(KIP1)免疫组化光密度值在 A、B、C、D组相互比较中, A组最高,D组高于C组,差异具有统计学意义,P=0.000(0.05)。
　　4、a-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学代表的增值平滑肌细胞的结果,其中A组(假手术组)表现为血管的中膜的平滑肌的细胞呈整齐的排列,有少数出现紊乱的表现,无新生内膜形成,表明经过2个月的高脂饮食喂养后,平滑肌细胞出现轻微增殖、迁移的表现,但尚未形成新生内膜。B组(动脉粥样硬化狭窄组)、C组(单纯裸支架组)、D组(支架+药物治疗组)中膜平滑肌细胞的排列较紊乱。法舒地尔能够显着抑制支架置入后平滑肌增生,进而影响新生内膜形成。
　　5、增殖细胞核抗原免疫组化结果示 A组(假手术组)见少量弱阳性棕黄色颗粒表达,B(动脉粥样硬化狭窄组)、C(单纯支架组)组中增殖细胞核抗原阳性表达明显多于 A组(假手术组),且主要位于中膜和内膜中,C组(动脉粥样硬化狭窄组)在支架周围增殖细胞核抗原阳性颗粒较多,增殖细胞核抗原免疫组化光密度值在 A(假手术组)、B(动脉粥样硬化狭窄组)、C(单纯支架组)、D组(支架+药物治疗组)组比较中,有统计学意义,P=0.000(0.05,表明支架长期炎性刺激使细胞增殖增多。
　　6、各指标之间相关性分析为了进一步了解颈动脉支架植入后内膜增厚的原因,采用Pearson相关系数对各指标的相关性进行分析,P27(KIP1)与 a-平滑肌肌动蛋白、增殖细胞核抗原呈正相关,并且差异有统计学意义。
　　结果：1.采用氮气干燥法结合球囊损伤内皮细胞,再饲以高脂饮食,能较好的建立比格犬颈总动脉粥样硬化狭窄模型。
　　2.比格犬颈动脉经过球囊损伤和氮气损伤内皮细胞后增生的血管中层中PCNA和a-平滑肌肌动蛋白表达明显增加, P27(KIP1)表达减少,表明P27(KIP1)减少可能通过促进平滑肌细胞的迁移和增殖,。
　　3、法舒地尔能够显着抑制支架置入后平滑肌增生内 P27(KIP1)表达下调,进而影响新生内膜形成。
　　结论：1、采用氮气干燥法结合球囊损伤内皮细胞,再饲以高脂饮食,能较好的建立比格犬颈总动脉粥样硬化狭窄模型。
　　2、比格犬颈动脉经过球囊损伤和氮气损伤后内皮细胞增生的血管中层中PCNA和a-平滑肌肌动蛋白表达明显增加, P27(KIP1)表达减少,表明P27(KIP1)减少可能通过促进平滑肌细胞的迁移和增殖。
　　3、比格犬颈动脉支架置入后内皮细胞增生明显,血管壁中层中PCNA和a-平滑肌肌动蛋白表达明显增加，法舒地尔组支架组新生内膜形成明显减弱，说明法舒地尔能够显着抑制支架置入后平滑肌增生内P27(KIP1)表达下调，进而影响新生内膜形成。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

前 言

材料与方法

1 实验材料和仪器

2 主要仪器和设备

3 主要实验试剂

4 实验方法

5 血管标本的采集

6．血液标本采集

7．比格犬颈动脉的彩超的检查

8．颈动脉的组织病理形态学的观察

9 HE染色的具体的步骤

10 结果判定

12 统计学处理

结 果

1、动物的一般情况

2. 比格犬的颈动脉的组织病理形态学的观察

3 三组颈动脉a-SMA的免疫组化表现

4 免疫组织化学检测三组颈动脉P27（KIP1）蛋白表达的比较

5 四组颈动脉PCNA的免疫组化表现

讨 论1

结 论

参考文献

Rho/Rho激酶信号通路与支架内再狭窄的研究综 述

1、Rho/Rho激酶信号通路

2、支架置入与Rho激酶活化

3、支架置入术后RhoA表达变化介导再狭窄

4、Rho激酶与球囊血管成形术后缩窄性重构及内膜增生

5、Rho激酶参与支架内血栓形成介导ISR发生

6、Rho激酶抑制剂与ISR防治

参考文献