电针耳穴对年龄相关性聋豚鼠听觉中枢蛋白质组影响的初步研究

摘要

目的： 建立 D-半乳糖年龄相关性聋豚鼠模型,探讨电针耳穴对 D-半乳糖所致的年龄相关性聋豚鼠听觉中枢蛋白质组的影响。方法：1. 分组及模型建立：成年豚鼠30只,按随机数字表法分成三组：D-半乳糖模型组10只,D-半乳糖+电针组10只,对照组10只,18月龄豚鼠 10 只作为自然老化组。D-半乳糖模型组予以 D-半乳糖(300mg/kg·day)颈背部皮下注射,每天1次,共六周；对照组予以等量生理盐水颈背部皮下注射,每天1次,连续6周；D-半乳糖+电针组予以D-半乳糖(300mg/kg·day)颈背部皮下注射,每日1次,半小时后予以电针听宫穴、翳风穴治疗15分钟,每日1次,连续6周。18 月龄组豚鼠常规饲养。2. 听力学检测：实验结束后各组进行听性脑干反应(Auditory brainstem response, ABR)和多频稳态诱发电位(Auditory steady state response, ASSR)检测。3. 听皮层蛋白质组图谱建立及差异蛋白的鉴定：用常规细胞裂解法裂解细胞提取蛋白, Bradford法测定蛋白质浓度。对照组、D-半乳糖模型组和D-半乳糖+电针组三组豚鼠听皮层进行双向电泳( Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)。第一向采用pH 4-7的固相pH梯度等电聚焦,第二向采用浓度为 10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。考染并照片获得双向电泳图谱,筛选出10个具有差异表达的蛋白斑点。切取蛋白质斑点,应用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱技术( Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)进行检测,获得各蛋白质的肽指纹图谱,结合2-DE图谱中各蛋白质点的等电点 ( Isoelectric point, PI )和分子量(Molecular weight, MW)值,利用Mascot软件进行匹配检索NCBI数据库来鉴定蛋白质。4.听皮层及下丘儿茶酚氧位甲基转移酶(Catechol-0-methyltransferase, COMT)、β-链蛋白(β-catenin)表达的研究：采用蛋白质印迹(Western blot)方法测定对照组、D-半乳糖模型组、D-半乳糖+电针组和 18 月龄组豚鼠听皮层及下丘COMT、β-catenin蛋白表达变化情况。5. 统计学方法：采用SPSS13.0软件进行分析,运用单因素方差分析检验,P<0.05具有统计学意义。结果：1. 体重变化：对照组、D-半乳糖模型组和 D-半乳糖+电针组三组豚鼠实验前体重、实验后体重差异无统计学意义(P>0.05)。2. ABR阈值变化：声强为132dB SPL、120 dB SPL时,各组ABR Ⅲ波潜伏期比较：对照组和D-半乳糖模型组、对照组和18月龄组、D-半乳糖+电针组和 D-半乳糖模型组之间差异有统计学意义(P<0.05) ,而 D-半乳糖模型组和 18 月龄组之间差异无统计学意义(P>0.05)。3. ASSR阈值变化：比较各组ASSR阈值在1kHz、2 kHz、4kHz时的变化,只有在4kHz时,对照组和D-半乳糖模型组之间差异有统计学意义( P<0.05 ) ,余各组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。4. 听皮层差异表达蛋白质：灰度差异大于 2 倍以上的10个蛋白斑点鉴定出的蛋白质分别是鸟嘌呤脱氨酶、ATP合酶β亚基、磷酸丙糖异构酶、肌酸激酶、丙酮酸脱氢酶E1复合体β亚基、α-烯醇化酶、磷酸甘油酸酯激酶-1、β-2A链样微管蛋白等8种蛋白。5.听皮层、下丘β-catenin蛋白表达变化：豚鼠听皮层、下丘β-catenin蛋白表达量在D-半乳糖模型和18月龄组下降,D-半乳糖+电针组表达量增加。对照组和D-半乳糖模型组、对照组和18月龄组、D-半乳糖+电针组和D-半乳糖模型组之间差异有统计学意义(P<0.05),而D-半乳糖模型组和18月龄组之间差异无统计学意义(P>0.05)。6.听皮层、下丘 COMT 蛋白表达变化：(1)听皮层：COMT 蛋白在D-半乳糖模型组和18月龄组表达降低,D-半乳糖+电针组表达增加。对照组和D-半乳糖模型组、对照组和18月龄组、D-半乳糖+电针组和 D-半乳糖模型组之间 COMT 蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05),而D-半乳糖模型组和18月龄组之间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)下丘：COMT蛋白在D-半乳糖模型组和18月龄组表达降低,D-半乳糖+电针组表达增加。对照组和D-半乳糖模型组、对照组和18月龄组、D-半乳糖+电针组和D-半乳糖模型组之间COMT蛋白表达差异有统计学意义( P<0.05 )。结论：1. D-半乳糖300mg/kg·day颈背部皮下注射6周可以建立年龄相关性聋豚鼠模型。2. 电针听宫穴、翳风穴能延缓豚鼠年龄相关性聋的发生。3. 鸟嘌呤脱氨酶等蛋白质可能参与了 D-半乳糖致豚鼠年龄相关性聋的发生和发展过程,电针听宫穴、翳风穴也可能通过调整以上蛋白质的表达来延缓年龄相关性聋的发生和发展。4. β-catenin 蛋白可能通过Wnt/β-catenin信号通路,调控细胞生长、分化及凋亡,参与听觉中枢的老化过程。电针听宫穴、翳风穴可能通过增加β-catenin蛋白表达,通过 Wnt/β-catenin 信号通路延缓豚鼠年龄相关性聋的发生。 5. COMT 蛋白可能通过调节儿茶酚胺的代谢,参与听觉中枢的老化过程。电针听宫穴、翳风穴可能通过增加 COMT 蛋白表达,提高儿茶酚胺类神经递质的释放,从而延缓豚鼠年龄相关性聋的发生。

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前言

材料与方法

1. 实验材料

2. 实验动物

3. 实验方法

4. 统计学方法

结果

1 电针耳穴对D-半乳糖致年龄相关性聋豚鼠体重变化的影响

2 豚鼠实验后ABR Ⅲ波潜伏期变化

3 豚鼠实验后ASSR听阈变化

4 三组豚鼠听皮层双向电泳图谱分析

5 蛋白斑点的质谱鉴定

讨论

1. D-半乳糖致豚鼠年龄相关性聋模型的建立

2. 针刺听宫穴、翳风穴能延缓年龄相关性聋的发生和发展

3. 年龄相关性聋豚鼠听皮层蛋白质组学分析方法的建立

4. 针刺听宫穴、翳风穴对年龄相关性聋豚鼠听皮层蛋白质组的影响

5.电针对年龄相关性聋豚鼠听皮层、下丘β-catenin、COMT表达的影响

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

蛋白质组学在听觉系统中的研究应用进展

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