TSP-1及其受体CD47在大鼠肾缺血再灌注损伤大鼠模型中的作用及机制初步探讨

摘要

目的:肾缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury, IRI）是急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)重要的组织病理学机制。由IRI引起的AKI是一个重要的临床问题，尽管AKI的治疗方法不断改进，但是肾IRI仍与AKI的发病率和死亡率密切相关。肾IRI的发生机制很复杂，且并未完全阐明，与氧自由基、内皮功能紊乱、炎症损伤、细胞坏死和凋亡等多方面均有关。已证实氧化应激产生的活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)在肾IRI中发挥了重要作用。在正常肾脏组织，基质蛋白血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)表达量很少。但在缺氧条件下，多种细胞可以合成TSP-1。有研究表明，TSP-1与AKI的发生和发展有关，同样也与慢性肾脏病的进展关系密切。因此，人们越来越多的关注TSP-1在急慢性肾脏病变中的地位。CD47又被称为整合素相关蛋白(integrin-associated protein，IAP)，是TSP-1的同源受体之一，它在肾脏广泛表达，但它在肾实质和间质细胞促进肾损伤的机制还不清楚。因此，本研究通过构建肾IRI大鼠模型，观察TSP-1及其受体CD47在IRI大鼠肾脏的分布情况及表达变化，以及血ROS的变化和肾组织氧化应激指标的变化，研究TSP-1、CD47在肾IRI时的表达及分布，以及与氧化应激的关系，探讨其在肾IRI发病机制中的作用。
　　方法:成年雄性SD大鼠42只，随机分为正常对照组(n=5)、假手术组(sham group，SG)(n=5)和模型组(n=32)，模型组下设IRI后1h、6h、12h、24h4个时间点，每个时间点8只大鼠。手术方式:将大鼠麻醉后，逐层开腹暴露双肾，用玻璃分针分离双侧肾动脉，将已经消毒的压脉带片段包裹在肾动脉外层，将手术线系在压脉带片段外迅速打结阻断肾血流，观察肾脏颜色的变化。阻断肾血流45min后，剪断手术线，恢复肾脏供血，观察肾脏颜色变化。逐层关腹，复苏。观察IRI后各组大鼠尿量变化，采用全自动生化分析仪检测各组大鼠的肾功能，通过苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)、糖原染色(periodicacid-schiff stain，PAS)了解肾脏病理损害，通过透射电镜观察足细胞有无损伤、系膜基质是否增生。采用流式细胞仪检测血ROS变化，采用酶联免疫吸附法测定肾组织中羟自由基和丙二醛的浓度，了解肾IRI损伤时的氧化应激状态。通过肾组织免疫组化，观察TSP-1和CD47蛋白在肾脏的表达及变化情况，通过免疫荧光双染了解TSP-1及其受体CD47在肾IRI时是否存在共表达。
　　结果:与正常对照组和假手术组相比，IRI各组大鼠尿量明显减少;肾IRI各组血肌酐(serum creatinine，Scr)和尿素氮（urea nitrogen，BUN）明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);随着缺血再灌注后时间的延长，肾小管出现不同程度的扩张、变性与坏死，间质炎性细胞浸润、充血水肿等变化。各组间肾小管HE染色病理损伤评分差异显著，差异具有统计学意义(P＜0.05);通过透射电镜观察发现肾IRI各组大鼠肾小球足细胞足突消失、系膜基质增生明显，足细胞计数差异具有统计学意义(P＜0.05)，而肾IRI各组间差异无统计学意义(P＞0.05);红细胞中ROS荧光强度阳性率逐渐升高，肾组织中的羟自由基和丙二醛的浓度呈逐渐升高趋势。在肾IRI早期，肾小管TSP-1、CD47表达即明显增加，至肾IRI24h时TSP-1、CD47在残存肾小管仍有较高表达。通过免疫荧光双染发现，在肾IRI肾小管TSP-1和CD47存在共表达。相关性分析发现ROS荧光强度阳性率与羟自由基和丙二醛的浓度呈正相关，与Scr、BUN、肾小管损伤评分、TSP-1积分光密度、CD47积分光密度呈正相关，与足细胞计数呈负相关。
　　结论:通过简易手术阻断双侧肾动脉血流，可以成功建立大鼠肾IRI模型。肾IRI后引起肾组织和全身的氧化应激反应，引起肾脏组织结构损害，足细胞损伤，肾功能异常。肾IRI时大鼠肾脏TSP-1和CD47表达明显升高，与肾组织和全身的氧化应激反应密切相关。TSP-1、CD47是肾小管损伤早期的一个预警指标，并伴随肾IRI整个过程持续表达，与ROS共同参与了肾IRI肾脏损伤过程。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 主要试剂

3 主要仪器和器材

4 主要试剂的配置

5 研究方法

结果

1 动物存活和纳入统计情况

2 各组大鼠尿量统计

3 实验室检查结果

4 肾脏病理

5 相关性分析

讨论

1 动物模型构建

2 氧化应激与肾IRI的关系

3 氧化应激与肾IRI足细胞损伤的关系

4 TSP-1及其受体CD47与肾IRI的关系

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

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致谢

TSP-1-CD47信号轴在肾缺血再灌注损伤中的作用机制研究进展 综述

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