维吾尔族饲鸽者肺免疫相关分子基因多态性、甲基化与细胞失衡机制的研究

摘要

目的:
　　维吾尔族饲鸽者肺免疫相关分子基因多态性、甲基化与细胞失衡机制的研究（MIP-1α基因单核苷酸多态性、HLA-DRB5基因甲基化及CD4+CD25+Foxp3+reg细胞与维吾尔族饲鸽者肺易感性的相关研究）。
　　方法:
　　1）根据纳入及排除标准收集资料，总纳入92例，其中饲鸽者肺组32例、阴性对照组（饲鸽未患病组）30例及正常对照组（健康体检组）30例。对纳入者的全血标本进行DNA提取，根据UCSC数据库中SNP位点的序列信息，利用MassARRAY技术设计引物、完成样品制备、PCR扩增、SAP、单碱基延伸、点样质谱检测对MIP-1α基因各位点进行多态性分析;
　　2)对纳入者的全血标本进行DNA提取、亚硫酸氢盐转化、PCR扩增、体外转录和RNaseA特异性酶切，并行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术检测HLA-DRB5基因甲基化情况;
　　3）根据纳入标准收集PBL病例组32例，其中急性期15例、慢性期17例，阴性对照组30例。采集所有纳入者的血样标本，采用流式细胞仪检测受试者外周血的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例和T淋巴细胞亚群。
　　上述资料采用SPSS17.0软件进行基本情况统计分析，其他采用SAS软件进行统计分析，H-W检验不平衡者均采用趋势卡方检验。
　　结果:
　　1）与正常对照组相比，患病组与阴性对照组血清中MIP-1α浓度均有明显的增高(P＜0.05);
　　2)检测已报道的MIP-1α基因24个位点，其中rs1049191、rs1049195、rs3210166、rs1130374、rs5029407rs1063340、rs190805628七个位点在维吾尔族饲鸽者中存在基因多态性(见质谱图);
　　3)Hardy-Weinberg平衡检验:MIP-1α基因rs1049191、rs1049195、rs3210166、rs1130374、rs5029407位点的基因型分布经检验均不符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＜0.05)，rs1063340位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05);
　　4)饲鸽者肺组、阴性对照组及正常对照组三组基因型频率分布比较:rs1049191、rs1049195、rs3210166、rs1130374、rs5029407、rs190805628位点的基因型频率分布差异有统计学意义(P＜0.05); rs1063340位点基因型分布频率比较差异无统计学意义(P＞0.05);三组间各位点等位基因频率分布比较差异均无统计学意义(P＞0.05);
　　5)饲鸽者肺组与正常组（阴性对照组及正常对照组）两组之间基因型频率分布比较: rs1049191、rs1049195、rs3210166、rs1130374、rs5029407位点基因型分布频率差异有统计学意义(P＜0.05); rs1063340及rs190805628位点基因型分布频率在两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);
　　6)连锁不平衡检验:本组SNPs位点经检验10组之间存在强的连锁不平衡:分别是rs1049191与rs1049195、rs1130374、rs3210166、rs5029407之间强LD; rs1049195与rs1130374、rs3210166、rs5029407之间强LD;rs1130374与rs3210166、rs5029407之间强LD: rs3210166与rs5029407之间强LD;C-C-G-G-C-C-C与T-A-G-A-C-G-T两种单体型可能与疾病发生相关;
　　7）检测到HLA-DRB5片段的18个CpG位点，CpG1、CPG2/3/4、CPG5/6/7、CpG8/9/10、CpG11/12/13、CpG14、CPG16/17/18/19，各个位点在三组样本中的甲基化率比较差异不具有统计学意义(P＞0.05)。
　　8)与对照组相比，急性期组、慢性期组外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例、CD4+CD25+Treg细胞比例明显降低，尤以急性期组降低显著（P＜0.01）;而急性期组和慢性期组比较，CD4+CD25+Treg细胞比例的差异无显著性(P＞0.05);
　　9)与对照组相比，急性期组和慢性期组外周血中CD4+T细胞％、CD4+/CD8+比值明显减少、CD8+T细胞％明显增加;三组结果比较差异有具有统计学意义(P＜0.01);
　　10)急性期组和慢性期组外周血中CD4+/CD8+比值与其外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例和CD4+CD25+Treg细胞的比例均呈正相关(r值分别为0.864和0.34，P＜0.05)。
　　结论:
　　1)MIP-1α基因rs1049191、rs1049195、rs3210166、rs1130374、rs5029407、rs190805628、rs1063340位点在维吾尔人群中存在基因多态性;
　　2）接触鸽子会引起MIP-1α浓度的增高，但尚未发现血清MIP-1α浓度增高与PBL发病存在相关性;
　　3）MIP-1α基因单核苷酸多态性与维吾尔族饲鸽者肺遗传易感性相关。其作用机制可能是MIP-1α基因外显子及启动子区SNP影响MIP-1α基因的转录和表达，继而影响PBL疾病的发生;
　　4)CC、GG基因型可能是维吾尔族PBL的易感因素，携带CC、GG基因型可能会增加维吾尔族饲养鸽子者患PBL的风险，这将从基因角度对于疾病的预防起到十分关键的作用;
　　5）未发现HLA-DRB5基因甲基化与维吾尔族饲鸽者肺之间存在关联;
　　6）维吾尔族饲鸽者肺患者体内CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的表达下调及过度消耗可能是饲鸽者肺发病机制中的重要因素，Treg细胞在维吾尔族饲鸽者肺发病的主要分子生物学机制可能是Th1/Th2机制失衡。通过流式法检测外周血Treg细胞比例及淋巴细胞亚群变化有助于协助诊断PBL疾病，目前国内外尚无此相关报道。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分 MIP-1α基因多态性与维吾尔族饲鸽者肺易感性的相关研究

1 研究内容与方法

1．1 研究对象

1．2 主要试剂和仪器设备

1．3 研究内容

1．4 研究方法

1．5 技术路线

1．6 统计学分析

2 结果

3 讨论

4 小结

第二部分 HLA-DRB5基因甲基化与维吾尔族饲鸽者肺相关研究

1 研究内容与方法

1．1 研究对象

1．2 主要试剂和仪器设备

1．3 研究内容

1．4 实验方法

1．5 技术路线

1．6 结果判读

1．7 统计学分析

2 结果

3 讨论

4 小结

第三部分 CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞与维吾尔族饲鸽者肺的相关研究

1 研究内容与方法

1．1 研究对象

1．2 研究内容

1．3 研究方法

1．4 统计学分析

2 结果

3 讨论

4 小结

结论

致谢

参考文献

附录

综述 过敏性肺炎：饲鸽者肺的病因、临床特点及发病机制研究

攻读博士学位期间获得的学术成果

个人简历

导师评阕表