花旗松素对毒死蜱诱导BV2细胞神经毒性保护机制的研究

摘要

目的:探讨花旗松素（Tax）对毒死蜱（CPF）诱导的BV2细胞神经毒性的保护机制，为小儿神经系统疾病的预防和治疗提供新的思路。
　　方法:①BV2细胞随机分为4组，因CPF和Tax均为脂溶性，易溶于DMSO，故设置DMSO组为对照组：DMSO组：含0.1％DMSO的RPMI1640完全培养基处理细胞，根据实验要求设置不同时间点；CPF组：含200μmol/L CPF的RPMI1640完全培养基处理细胞，作用时间6 h；Tax组：含Tax的RPMI1640完全培养基预处理细胞，根据实验要求设置不同浓度、不同时间点；Tax+CPF组：含100μmol/L Tax的RPMI1640完全培养基预处理细胞，作用时间6 h；再用含200μmol/L CPF的RPMI1640完全培养基处理细胞，作用时间6 h。②CCK-8法检测Tax对BV2细胞活力的影响；光镜下观察细胞形态学变化；③荧光染色法检测 BV2细胞内活性氧(ROS)水平；④酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞上清TNF-α和IFN-γ蛋白表达；⑤免疫荧光染色（IF）检测自噬标志性蛋白 LC3Ⅱ表达；⑥免疫印迹法（Western blot）检测 p-AMPK, AMPK,Nrf2, HO-1,p62蛋白表达水平以及Conpound C阻断AMPK通路后，再次检测上述蛋白表达水平。
　　结果:①光镜下可见CPF诱导的BV2细胞胞体变圆，细胞突触萎缩，且贴壁性变差，细胞聚集漂浮；Tax、Tax+CPF两组BV2细胞形态较为靠近DMSO组，贴壁性较CPF组好，无明显聚集现象。②荧光显微镜下观察可见DMSO组绿色荧光很少且亮度较弱，CPF组绿色荧光较多且亮度增强，而Tax和Tax+CPF灵族细胞绿色荧光减少且荧光亮度减弱。与DMSO组比较，CPF组ROS增多，Tax、Tax+CPF组ROS无增多；与CPF组比较，Tax、Tax+CPF组ROS降低。③ELISA检测各组细胞上清液中TNF-α和IFN-γ水平示：与DMSO组比较，CPF、Tax+CPF两组细胞TNF-α和IFN-γ水平升高，Tax组细胞TNF-α水平无升高，IFN-γ水平升高；与CPF组比较，Tax和Tax+CPF组细胞TNF-α和IFN-γ的水平均有下降。④免疫荧光染色.结果示：LC3 II主要在细胞质中表达，与DMSO组比较，CPF组细胞LC3 II在细胞质中表达未见增多，Tax和Tax+CPF两组细胞LC3 II在细胞质中表达增多。同时，western blot实验结果示：与DMSO组比较，CPF组细胞p62相对表达无显著差异；Tax组细胞p62相对表达量增多，Tax+CPF组细胞p62下降，但差异无统计学意义。⑤western blot实验结果示：与DMSO组比较，CPF组AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表达无明显改变，Tax组AMPK、p-AMPK蛋白表达无显著改变， Nrf2、HO-1蛋白表达减少，但差异无统计学意义，Tax+CPF组AMPK蛋白无显著改变，p-AMPK蛋白表达减少，Nrf2、HO-1蛋白表达无显著增加；与CPF组比较，Tax组AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表达无显著改变，Tax+CPF组p-AMPK蛋白表达减少，Nrf2、HO-1蛋白表达增加，但差异无统计学意义。Conpound C干预各组BV2细胞1 h后，实验结果可见与DMSO组比较，CPF组AMPK蛋白表达显著减少， Tax组AMPK、Nrf2蛋白表达明显减少，p-AMPK、HO-1蛋白表达减少，但差异无统计学意义，Tax+CPF组AMPK、p-AMPK显著较少，Nrf2、HO-1蛋白表达无显著差异；与CPF组比较，Tax组AMPK显著升高，p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表达无显著差异，Tax+CPF组AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表达无显著差异。
　　结论:①CPF对BV2细胞具有毒性作用，表现为BV2细胞胞体变圆，细胞突触萎缩，且贴壁性变差，细胞聚集漂浮，BV2细胞存活率降低。同时，CPF可以上调ROS、TNF-α、IFN-γ水平，诱导BV2细胞发生氧化应激、炎症反应。②Tax可以改善BV2细胞活力，对CPF诱导BV2细胞神经毒性具有保护作用；Tax下调ROS、TNF-α、IFN-γ、p62水平，上调LC3II水平，提示Tax可以减轻炎症及氧化应激反应、促进自噬，对CPF诱导的BV2细胞毒性发挥保护作用。③Tax下调p-AMPK水平，上调Nrf2、HO-1水平，提示Tax对CPF诱导的BV2细胞毒性的保护机制可能是通过下调p-AMPK水平，激活Nrf2/HO-1信号通路实现。

目录

声明

英文缩略词表

前言

实验设计

材料与方法

1细胞系

2主要实验仪器、试剂及耗材

3主要溶液配制

4实验分组：

5实验方法

实验结果

1 Tax对BV2细胞活力的影响

2 Tax对CPF诱导的BV2细胞形态学的影响

3 Tax对CPF诱导的BV2细胞氧化应激的影响

4 Tax对CPF诱导的BV2细胞炎症反应的影响

5 Tax对CPF诱导的BV2细胞自噬的影响

6 Tax下调p-AMPK水平，激活Nrf2/HO-1通路

讨论

1 Tax改善BV2细胞活力

2 Tax改善BV2细胞形态

3 Tax明显减轻CPF诱导的BV2细胞氧化应激

4 Tax明显减轻CPF诱导的BV2细胞炎症反应

5 Tax促进自噬的发生

6 Tax通过下调p-AMPK水平，激活Nrf1/HO-1通路发挥抗氧化应激，抗炎作用，促进自噬的发生。

小结

致谢

参考文献

综述:毒死蜱对神经系统毒性作用及机制的研究进展

攻读硕士学位期间的研究成果

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