高糖环境下UBA52与肾小管上皮细胞转分化信号通路TGF-β/Smad关系的研究

摘要

目的：探讨不同浓度葡萄糖对NRK-52E细胞的UBA52和TGF-β1/Smad表达的影响。采用RNA干扰技术对泛素-核糖体融合蛋白52（UBA52）沉默，观察其对高糖环境下鼠肾小管上皮细胞NRK-52E转分化信号通路转化生长因子β1（TGF-β1/Smad）的影响。
　　方法：体外培养大鼠肾NRK-52E细胞，将其分为正常对照组（葡萄糖浓度为5.6mmol/L）、高渗对照组（5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L甘露醇）、葡萄糖中浓度组（葡萄糖浓度为20mmol/L）、葡萄糖高浓度组（葡萄糖浓度为30mmol/L）进行培养。采用CCK-8检测各组细胞增殖情况。光镜下观察细胞生长状态改变。上述四组细胞干预48小时后，采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot法检测各组α-SMA、TGF-β1、Smad7、UPP1、UBA52 mRNA及蛋白的表达。采用设计并合成的UBA52 siRNA序列对其进行沉默。将大鼠肾NRK-52E细胞空白对照组（高糖30mmol/L），阴性对照组（高糖30mmol/L+乱序siRNA），转染组（高糖30mmol/L+UBA52 siRNA）培养48小时后，采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot法检测各组α-SMA、TGF-β1、Smad7和UPP1 mRNA及TGF-β1、Smad2/3和Smad7蛋白的表达。比较各组间的差异。
　　结果：正常对照组大鼠肾NRK-52E细胞呈贴壁状，细胞间紧密连接，单层融合呈铺路石样排列。葡萄糖高浓度组大鼠肾NRK-52E细胞形态则呈现梭型，细胞拉长更为明显和普遍，细胞间隙开始变大。在处理后的第48h和72h时，CCK-8检测四组细胞数量均有统计学差异，葡萄糖高浓度组细胞数量显著高于其余三组，并且葡萄糖中浓度组细胞数量显著高于高渗对照组和正常对照组。葡萄糖高浓度组α-SMA mRNA的表达显著高于其余三组，是正常对照组的3.79倍。葡萄糖高浓度组Smad7 mRNA的表达显著低于其余三组，其余三组之间差异并无统计学意义。然而葡萄糖高浓度组的TGF-β1 mRNA表达则显著高于其余三组。经过中浓度和高浓度葡萄糖刺激后，大鼠肾NRK-52E细胞UBA52mRNA表达显著升高，显著高于正常对照组和高渗对照组。葡萄糖高浓度组α-SMA、TGF-β1、UBA52蛋白的表达显著高于其余三组。沉默UBA52基因后，三组α-SMA mRNA的表达显则无显著差异。转染组TGF-β1 mRNA的表达显著低于其余两组。然而Smad7 mRNA则在转染组高表达。空白对照组、阴性对照组、转染组三组的TGF-β1、Smad2/3蛋白表达组间差异均有统计学意义，转染组表达均明显低于其它两组。三组Smad7的表达间差异有统计学意义，转染组Smad7蛋白表达较其它两组明显增加。
　　结论：高糖能够上调NRK-52E细胞UBA52mRNA的表达，激活TGF-β1/Smad信号通路。沉默UBA52基因可对高糖环境下大鼠NRK-52E细胞TGF-β1/Smad信号通路产生负调控。

目录

声明

中英文缩略词对照表

前言

研究内容与方法

1 研究对象

2 研究内容与方法

3 质量控制

4 统计学处理

5 技术路线图

结果

1 高糖对大鼠肾NRK-52E细胞形态影响

2 高糖对大鼠肾NRK-52E细胞增殖的影响

3高糖对大鼠肾NRK-52E细胞α-SMA、TGF-β1和Smad7 mRNA表达的影响

4高糖对大鼠肾NRK-52E细胞UPP1、UBA52 mRNA表达的影响

5 高糖对大鼠肾NRK-52E细胞α-SMA、TGF-β1、Smad7、UPP1和UBA52蛋白表达的影响

6 UBA52siRNA转染的结果及转染效率的验证

7 UBA52基因沉默对高糖环境下大鼠NRK-52E细胞转分化信号通路的影响

讨论

小结

致谢

参考文献

综述:糖尿病肾病肾间质纤维化发病机制研究进展

攻读硕士学位期间发表的学术论文

个人简历

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