HLA限制性HPV16 E6、E7抗原特异性T细胞免疫反应与宫颈鳞癌临床特征及预后分析

摘要

目的:1)对新疆地区维吾尔族与汉族中晚期宫颈鳞癌患者的临床特征和预后影响因素进行综合分析评价;2)探讨HLA-I和Ⅱ类等位基因及其单倍体型在本地区中晚期宫颈鳞癌和健康人群中的分布特征及其差异,分析HLA多态性和宫颈鳞癌患者HPV表达及预后的关系,寻找相关易感基因及保护基因;3)筛查中晚期宫颈鳞癌患者HLA限制性HPV16 E6、E7抗原特异性肽段,为该地区宫颈鳞癌患者疫苗研究提供靶肽. 方法:1)回顾收集在新疆医科大学附属肿瘤医院收治的中晚期宫颈鳞癌初治患者853例,对比分析维吾尔族与汉族两组患者临床病理参数并进行随访,了解预后,寻找中晚期宫颈鳞癌患者预后相关指标;2)收集100例维吾尔族与75例汉族中晚期宫颈鳞癌患者和无宫颈癌家族史的同时期100例维吾尔族与100例汉族健康志愿者女性的外周静脉血,应用PCR-SBT法检测研究对象HLA等位基因的表达,比较宫颈鳞癌患者以及健康对照人群中HLA-I和II类等位基因多态性和单倍体型的分布情况,分析HLA分型和中晚期宫颈鳞癌患者HPV表达及预后关系,寻找与宫颈鳞癌相关的等位基因位点和联合易感基因及保护基因;3)由前部分研究对象中选取人乳头瘤病毒分型检测结果为HPV16型并无合并传染病的宫颈鳞癌患者和HPV阴性的健康人群,从其外周静脉血中分离PBMC,应用ELISpot试验方法检测中晚期宫颈鳞癌患者和健康对照人群外周血T细胞对HPV全基因组序列肽抗原特异性CTL免疫反应水平,比较HPV全基因组表达的抗原肽对中晚期宫颈鳞癌患者的细胞免疫反应.同时人工合成E6和E7抗原蛋白的重叠肽,刺激HPV16阳性宫颈鳞癌患者PBMC产生IFN-γ,与第二部分HLA结果结合,筛查宫颈鳞癌患者HLA限制性HPV16 E6、E7抗原特异性肽段 .结果:1)维吾尔族与汉族中晚期宫颈鳞癌患者在初潮年龄、结婚年龄、结婚次数、孕次、产次、流产次数、肿瘤家族史、BMI、PNI、宫颈外观表现、PLTc、FBG、OS和DSS等方面的差异有统计学意义(P<0.05).生存分析结果显示民族、FIGO分期、SCC-Ag、FBG和NLR等是新疆地区中晚期宫颈鳞癌患者DSS的预后影响因素,而FIGO分期、SCC-Ag、PLTc、FBG、NLR和肿瘤家族史等是其DFS的预后影响因素;2)维吾尔族健康对照人群中A*01:01、A*03:01、A*03:02、B*14:02、Cw*05:01、DRB1*13:01、DQB1*05:02和DQB1*06:02等位基因频率高于汉族健康对照人群组,而A*11:01、A*24:02、A*30:01、B*15:01、B*40:01、Cw*14:02、DRB1*09:01和DQB1*03:03等位基因频率低于汉族健康对照人群,差异均有统计学意义(P<0.05);中晚期宫颈鳞癌患者中B*35:03、DRB1*07:01、DRB1*04:04、DRB1*04:07、DRB1*08:03、DRB1*15:02、DQB1*02:01等位基因和 Cw*01:02-DRB1*09:01、Cw*01:02- DQB1*03:03、DRB1*07:01-DQB1*02:01、DRB1*15:01-DQB1*06:02等单倍体型频率高于健康对照人群,而B*15:01、B*44:02、B*58:01、Cw*03:02、DRB1*04:03、DRB1*08:01、DRB1*12:01、DRB1*16:01、DQB1*06:05等位基因和 B*58:01- Cw*03:02、DRB1*03:01-DQB1*02:02、DRB1*04:01-DQB1*03:02、DRB1*09:01- DQB1*03:01等单倍体型频率低于健康对照人群,差异均有统计学意义(P<0.05).维吾尔族宫颈鳞癌患者中 DRB1*07:01、 DRB1*15:02、 DQB1*02:01等位基因和A*01:01-Cw*06:02、A*01:01-DRB1*07:01、B*50:01-Cw*06:02、DRB1*07:01-DQB1*02:01、DRB1*15:02-DQB1*06:01、Cw*06:02-DRB1*07:01-DQB1*02:01等单倍体型频率高于维吾尔族健康对照人群,而B*44:02、B*58:01、Cw*03:02、Cw*05:01、DRB1*04:01、DRB1*12:01、DQB1*05:02等位基因和DRB1*04:01-DQB1*03:02、DRB1*12:01-DQB1*03:01、DRB1*13:01-DQB1*06:02等单倍体型频率低于维吾尔族健康对照人群,差异均有统计学意义(P<0.05).汉族宫颈鳞癌患者中A*02:07、B*46:01、DRB1*04:07、DRB1*08:03等位基因和A*02:07-B*46:01、A*02:07-Cw*01:02、A*02:07-Cw*03:04、B*46:01-Cw*01:02、B*46:01-DRB1*09:01、B*46:01-DQB1*03:03、Cw*01:02-DRB1*09:01、Cw*01:02-DQB1*03:03、DRB1*08:03-DQB1*06:01、DRB1*09:01-DQB1*03:03等单倍体型频率高于汉族健康对照人群,而A*24:02、DRB1*04:03、DRB1*08:01、DRB1*12:01等位基因和A*24:02-Cw*04:01和DRB1*12:01-DQB1*03:01等单倍体型频率低于汉族健康对照人群,差异均有统计学意义(P<0.05);宫颈鳞癌患者中B*15:01、B*44:02和Cw*05:01等位基因与HPV表达, B*44:02、DRB1*08:01和DRB1*07:01等位基因与HPV16表达有关.维吾尔族宫颈鳞癌患者中 A*01:01-Cw*06:02、A*01:01-DRB1*07:01、B*50:01-Cw*06:02和Cw*06:02- DRB1*07:01-DQB1*02:01等单倍体型与 HPV表达, B*44:02和DRB1*08:01等位基因以及Cw*06:02-DRB1*07:01-DQB1*02:01单倍体型与HPV16表达有关(P<0.05).携带A*24:02等位基因的同步放化疗宫颈鳞癌患者DSS高于未携带患者,而携带DRB1*09:01和DQB1*02:01等位基因的同步放化疗宫颈鳞癌患者DFS均低于未携带患者.影响中晚期宫颈鳞癌患者DSS的预后影响因素有FIGO分期、治疗方式、NLR、PLTc、FBG和A*24:02等位基因等,而DFS的预后影响因素有民族、FIGO分期、PLTc和DRB1*09:01等位基因等;3)用HPV全基因组抗原肽刺激中晚期宫颈鳞癌患者与健康对照人群外周血PBMC后发现,宫颈鳞癌患者中E6和E7抗原肽CTL免疫阳性反应频率高于健康对照人群,E7抗原肽的反应强度高于健康对照人群,亚组分析结果显示维吾尔族中晚期宫颈鳞癌患者中E7抗原肽的反应强度高于健康对照人群,汉族宫颈鳞癌患者中E7抗原肽的CTL免疫阳性反应频率和反应强度均高于健康对照人群(P<0.05).根据第二部分分析确定的与中晚期宫颈鳞癌密切相关的HLA靶基因(A*24:02和DRB1*09:01)进行进一步筛选E6、E7抗原肽的细胞表位,携带A*24:02等位基因的HPV16阳性宫颈鳞癌患者中 E6" Peptide-14 DLLIRCINCQKPLCPEEK"和 E7" Peptide-9 LRLCVQSTHVDIRTLEDL"重叠肽出现的频率和强度最高,携带DRB1*09:01等位基因的HPV16阳性宫颈鳞癌患者中E6"Peptide-15 CQKPLCPEEKQRH LDKKQ"重叠肽表现为阳性反应. 结论:1)新疆地区维吾尔族与汉族中晚期宫颈鳞癌患者在患病情况、临床病理特征以及预后均存在一定的差异.本地区中晚期宫颈鳞癌患者预后可能与民族、FIGO分期、SCC-Ag、PLTc、FBG、NLR和肿瘤家族史有关;2)宫颈鳞癌和健康人群HLA多态性分布存在一定差异,对宫颈鳞癌起易感或保护作用的HLA等位基因和单倍体型对识别和清除HPV感染以及宫颈鳞癌演变过程有一定的影响.A*24:02等位基因可能对宫颈鳞癌患者DSS起保护性作用,而DRB1*09:01和DQB1*02:01等位基因可能对宫颈鳞癌患者DFS起危险性作用.影响本地区中晚期宫颈鳞癌患者预后影响因素有民族、FIGO分期、治疗方式、NLR、PLTc、FBG和A*24:02及DRB1*09:01等位基因等,其中A*24:02和DRB1*09:01等位基因可能与宫颈鳞癌发生、发展相关的HLA靶基因位点;3)HPV16 E6、E7抗原肽为引起宫颈鳞癌发生、发展的致瘤蛋白,可能成为宫颈鳞癌免疫治疗的理想研究靶点.HLA-A*24:02等位基因限制性HPV16 E6"Peptide-14 DLLIRCINCQKPLCPE EK"和E7"Peptide-9 LRLCVQSTHVDIRTLEDL"重叠肽,DRB1*09:01等位基因限制性HPV16 E6"Peptide-15 CQKPLCPEEKQRHLDKKQ"重叠肽可能为研制疫苗提供研究方向.

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摘 要

Abstract

前 言

第一部分 新疆地区维吾尔族与汉族宫颈鳞癌临床病理特征的回顾和预后分析

1 研究内容与方法

1.1 研究内容

1.2 资料来源

1.3 研究方法

1.4 统计学分析

2 结果

3 讨论

4 小结

第二部分 HLA-I和II类基因多态性与宫颈鳞癌临床特征及预后关系研究

1 研究内容与方法

1.1 研究对象和内容

1.2 材料与试剂

1.3 实验方法

1.4 质量控制

1.5 统计学分析

2 结果

3 讨论

4 小结

1 研究内容与方法

1.1 研究对象和内容

1.2 材料与试剂

1.3 实验方法

1.4 质量控制

1.5 统计学分析

2 结果

3 讨论

4 小结

结 论

致 谢

参考文献

综述

攻读博士学位期间获得的学术成果

个人简历

导师评阅表