5-氮杂-2'-脱氧胞苷对宫颈鳞癌细胞HPV16 E6/E7、P53、pRb、Twist1影响的体外研究

摘要

目的：
　　宫颈癌是一种危害妇女健康的恶性肿瘤。持续高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是发生宫颈上皮内瘤样病变（CIN）和宫颈癌（CC）的最主要病因，尤其是HPV16、18型感染。HPV16/18致病机制主要通过病毒致癌基因E6和E7分别与抑癌基因p53和视网膜母细胞瘤蛋白pRb结合。E6抑制p53的活性，E7抑制pRb的活性，使这些抑癌蛋白丧失功能，引起细胞的无限增殖和恶性转化，阻止细胞凋亡而致肿瘤发生。而癌的发生是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程。
　　研究表明，表观遗传学的改变和人类多种肿瘤的发生密切相关，抑癌基因DNA甲基化则是宫颈癌中最重要的表观遗传学修饰形式。表观遗传学改变与肿瘤遗传学改变不同，它具有可逆性，DNA去甲基化药物可以使表观遗传学机制介导的沉默基因恢复表达。因此研究去甲基化药物具有较深远的意义。
　　上皮-间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是指具有极性的上皮细胞转化成具有运动能力的间质细胞的过程，并获得迁移和侵袭的能力。研究表明，EMT在宫颈癌进展中具有重要作用。Twist是碱性螺旋-环-螺旋（basic Helix-Loop-Helix，bHLH）转录因子家族成员，包括Twist1(即Twist)和Twist2。Twist1被认为是参与EMT过程中的关键调控因子，在肿瘤侵袭和转移中具有重要作用。此外，研究发现Twist1在宫颈癌中也存在DNA甲基化修饰，因此Twist1在EMT和DNA甲基化过程中均发挥作用。
　　以往有较多研究发现去甲基化药物5-Aza-CdR对宫颈癌SiHa、HeLa细胞的增殖具有抑制作用，且具有浓度及时间依赖性，即随着浓度的升高（0.1-100umol/L）及时间的延长（24h、48h、72h、96h）对宫颈癌细胞增殖抑制作用逐渐加强。但其对HPV E6/E7的研究不一致。有些研究者发现5-Aza-CdR可降低HPV E6/E7的表达，而另一些研究者则认为5-Aza-CdR对其没影响。5-Aza-CdR对P53的研究较少，尚未发现对pRb、Twist1的研究。本课题以HPV16阳性的SiHa细胞为研究对象，探讨DNA转移酶抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对宫颈癌SiHa细胞HPV16E6/E7、P53、pRb、Twist1表达水平的变化。观察5-Aza-CdR能否通过去甲基化作用上调抑癌基因P53、pRb的表达，降低癌基因Twist1的表达，为去甲基化药物应用于宫颈鳞癌的临床治疗提供实验依据。
　　方法：
　　1选取宫颈鳞癌SiHa细胞株进行培养。
　　2采用四氮唑蓝（MTT）比色法检测其对SiHa细胞增殖的影响：实验组设5-Aza-CdR的浓度分别为10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L，干预72h，对照组为未加药物组。每组设5个复孔。酶标仪检测吸光度，计算细胞活力。考察5-Aza-CdR对SiHa作用的量效关系。选取40μmol/L5-Aza-CdR处理组与对照组，进行后续研究。
　　3采用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative RT-PCR)）方法检测实验组与对照组HPV16 E6/E7、p53、pRb、Twist1基因mRNA表达水平，并比较两组间的差异。
　　4应用Western-blot检测实验组与对照组p53、pRb、Twist1蛋白的表达水平，并比较两组间的差异。
　　结果：
　　1经终浓度分别为0μmol（对照组）、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L5-Aza-CdR处理SiHa细胞72h以后， MTT检测对照组与10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L实验组的细胞活力（A490值）分别为：0.551±0.023、0.488±0.011、0.467±0.012、0.437±0.019，各实验组与对照组均存在差异，有统计学意义（F=56.010，P=0.000）。在一定浓度范围内随着5-Aza-CdR浓度的增加，SiHa细胞活力下降，抑制作用逐渐增强，呈量效关系。
　　2经终浓度40μmol/L5-Aza-CdR处理SiHa细胞72h以后，采用RT-PCR分别检测实验组与对照组HPV16 E6/E7、p53、pRb、Twist1基因的mRNA含量。结果为：HPV16E6/E7 mRNA相对表达量较对照组降低， P<0.05；p53、pRb mRNA表达量在实验组中较对照组升高，P<0.05；Twist1 mRNA表达水平在实验组中较对照组下降，P<0.05。
　　3经终浓度40μmol/L5-Aza-CdR处理SiHa细胞72h以后，Western-blot检测结果显示：实验组抑癌基因p53蛋白的表达量（0.54±0.03）较对照组（0.50±0.04）明显升高，P<0.05；实验组pRb蛋白表达量（0.51±0.04）较对照组（0.44±0.04）明显升高， P<0.05；实验组癌基因Twist1表达量（0.50±0.04）较对照组（0.62±0.03）表达明显降低，P<0.05。
　　结论：
　　15-Aza-CdR能抑制宫颈鳞癌SiHa细胞增殖，在一定浓度内抑制作用逐渐增强，呈量效关系；
　　25-Aza-CdR能降低宫颈癌SiHa细胞株中HPV16 E6/E7的mRNA含量；
　　35-Aza-CdR能上调抑癌基因P53、pRb的mRNA含量和蛋白表达；
　　45-Aza-CdR能降低癌基因Twist1的mRNA含量和蛋白表达，可能借此抑制宫颈鳞癌的EMT过程。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结果

1 5-Aza-CdR对SiHa细胞形态及增殖的影响

2 5-Aza-CdR对SiHa细胞HPV16 E6/E7、p53、pRb、Twist1基因mRNA表达水平的影响

3.5-Aza-CdR对SiHa细胞p53、pRb、Twist1基因蛋白表达水平的影响

附图

附表

讨论

1 HPV致病机制及5-Aza-CdR对HPV E6/E7mRNA的影响

2 P53功能及5-Aza-CdR对P53的影响。

3 pRb功能及5-Aza-CdR对pRb的影响

4 Twist1功能及5-Aza-CdR对Twist1的影响

结论

参考文献

综述:DNA甲基化在宫颈癌筛查及治疗中的价值

致谢

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