海岛棉（Gbarbadense L.）茎尖再生体系的建立及农杆菌介导抗虫基因（Bt;SATI）转化研究

摘要

本实验以海岛棉新海20，新海16，K222，97006为转化受体品种(系)，采用农杆菌介导法将抗虫基因BT、SATI转化棉花茎尖外植体。通过对影响组织培养和转化的相关因素的研究，建立起了适宜于海岛棉的农杆菌介导的茎尖遗传转化体系。本研究为海岛棉转基因育种提供了技术支持。主要研究结果如下： 1．建立了海岛棉茎尖再生体系。无菌条件下，脱绒种子用70﹪乙醇浸润30S，再经过0.1﹪的升汞消毒10min后，用无菌水冲洗3-5次，28℃，浸种12-16h至“露白”，剥去种皮在自来水发芽培养基上生长。以MSB<,5>(即MS1)为基本培养基，取不同苗龄茎尖在附加不同浓度激素的培养基中继代培养，对不同的培养基进行筛选优化。在9种不同的激素组合中，以6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L与1/2MSBs+IBA 0.1 mg/L 再生效果较好；同时，结果表明，棉花茎尖诱导成苗时，基因型之间差异不显著。 2．建立了以海岛棉茎尖为受体的转化体系。通过对影响转化频率相关因子的研究，以及对头孢霉素(Cef)抑菌浓度、卡那霉素(Kan)筛选浓度、农杆菌菌株的比较筛选，证明了海岛棉茎尖可做为良好的受体材料并且获得了根癌农杆菌介导的海岛棉茎尖转化体系：未经预培养的带下胚轴0.5-0.8cm的茎尖在OD<,600>=0.8 的根癌农杆菌菌液中浸染20-30min，共培养48-72h；选择培养以200mg/LCef为抑菌浓度，150mg/LKan为最高筛选浓度；两种菌株比较结果EHA105的侵染转化率高于LBA4404。 3．转基因植株的PCR检测对抗性植株进行PCR扩增检测，得到了与阳性对照 Bt(1080bp)目的基因相同的特异性片段，转化率达到0.7﹪。将转基因植株嫁接定植成活。由此，从分子水平上初步证明外源抗虫基因已经整合到了再生植株的基因组中。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号和缩略语

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第一章研究综述

1.1植物基因工程研究进展及应用

1.2棉花转基因研究进展

1.2.1棉花概述

1.2.2棉花转基因研究概况

1.2.3用于棉花转化的主要目的基因及其应用

1.3遗传转化方法

1.3.1农杆菌介导法

1.3.2花粉管通道法

1.3.3基因枪转化法

1.4棉花组织培养

1.5农杆菌介导棉花基因转化的影响因素

1.5.1植物基因型

1.5.2外植体来源

1.5.3生理状态

1.5.4外植体预培养与共培养

1.5.5药物选择及药物筛选压力的选择

1.6本研究的目的和意义

第二章海岛棉茎尖再生体系的建立

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.2.1基因型对茎尖生长分化的影响

2.2.2不同茎尖分生组织对再生的影响比较

2.2.3激素种类、组合及附加成分对茎尖培养效果的影响

2.2.4不同定植方法对成活率的影响

2.2.5不同苗龄及基因型对茎尖生长分化的影响

2.3讨论

2.3.1基因型与再生成苗的关系

2.3.2激素对棉花茎尖分化的影响

2.3.3再生苗的移栽与嫁接

2.3.4下胚轴的剪取对成苗的影响

第三章海岛棉茎尖遗传转化影响因子的研究

3.1材料和方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与分析

3.2.1质粒的鉴定及其质粒转化农杆菌

3.2.2 Kan筛选压的确定

3.2.3农杆菌感染浓度对遗传转化的影响

3.2.4侵染时间对抗性苗率的影响

3.2.5共培养方式和时间对再生频率的影响

3.2.6两种农杆菌菌株的比较

3.3讨论

3.3.1菌液PCR扩增反应体系

3.3.2农杆菌菌株的选择

3.3.3受体材料的选择

3.3.4外植体的褐变

3.3.5菌液的制备

3.3.6抑菌剂对外植体的影响

第四章转基因抗性植株的检测

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.2.1 PCR检测

4.2.2抗性植株叶片涂抹检测

4.3讨论

第五章结论

5.1建立了高效的海岛棉茎尖再生体系

5.2建立了以海岛棉茎尖为受体的农杆菌介导抗虫基因转化体系

5.3初步获得了7个转基因植株

5.4嫁接法是有效的再生苗定植方法

5.5农杆菌EHA105菌株具有较高的转化效率

参考文献

致谢

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附图