哈密瓜内生拮抗细菌抗菌活性物质研究

摘要

本论文从378株哈密瓜内生细菌中筛选出了对瓜类细菌性叶斑病菌、疫霉病菌具有高抗菌活性的拮抗菌株，研究了拮抗菌株产生抑菌物质的种类、性质、稳定性、产生条件及抗菌机制，为内生生防菌抗菌机制的分子生物学和遗传改良研究，挖掘新的抗病基因资源，创制优良生防制剂提供科学基础。 研究结果显示：在哈密瓜内生细菌中广泛存在具有高抗菌活性的菌株。通过测定拮抗菌株胞外代谢产物的抑菌活性，复筛出胞外代谢物中活性较高的抑菌物质，其中194、197菌株的胞外代谢物表现出高抗菌活性．温室生物测定证明，197菌株的菌体和胞外代谢物对细菌性叶斑病菌和疫霉病菌具有双重显著抗菌活性，还同时具有促进种子发芽和促进生长的作用，胞外代谢物防病效果较菌体更为显著。 对内生拮抗菌株产生抑菌物质的初步分析表明，试验分离筛选出的内生拮抗菌株能产生细菌素，几丁质酶，嗜铁素等多种抑菌代谢产物，产生抑菌活性物质是其抗菌作用的重要机制。 对试验筛选出的高拮抗活性菌株197的抗菌物质进行了研究。结果表明，197菌株的代谢抗菌物质为蛋白质类，可通过15﹪-90﹪的(NH<,4>)<,2>SO<,4>盐析和浓缩，其蛋白含量与其抗菌活性呈正相关，75﹪(NH<,4>)<,2>SO<,4>是抗菌蛋白提取的最适盐析饱和度。 采用PAGE和SDS-PAGE凝胶电泳法从197菌株的粗蛋白提取物中检测分离到了P5-3和P5-6两种抗菌蛋白成分。对其中抑菌活性较强P5-3抗菌蛋白进行纯化，得到了电泳纯的抗菌蛋白，分子量约为45KD，有两条链组成。该抗菌蛋白与已报道的抗菌蛋白有一定差别，可能为一种新的未知抗菌蛋白。 该抗菌蛋白具有较强的热稳定性，120℃高温处理10min仍能保持部分抑菌活性。对pH值适应范围较宽，在pH8的碱性条件下更为稳定。对蛋白酶K敏感，对胰蛋白酶部分敏感，对紫外线有很强的稳定性，4℃低温下存放42天后仍可保持抑菌活性。 197菌株抗菌蛋白抗菌谱的测定结果显示，该抗菌蛋白抗菌谱较广，对多种病原菌具有抗菌作用。其抗菌作用表现在能显著抑制疫霉菌孢子的形成，降低孢子萌发率，还能引起病原菌菌丝壁溶解，原生质泄漏。对细菌性叶斑的抑制作用则表现为菌体表面粗糙，细胞形态不规则，甚至馈溶现象。 通过单因子和多因子正交试验，确定197菌株摇瓶培养产生抑菌物质的最佳条件为：在装液量为50mL/300mL，40℃下，初始pH7的NA培养液中，120rpm，振荡培养72h。 经形态、结构、培养性状和生理生化特性测定，结合16SrDNA分子鉴定方法，将197菌株鉴定为蜡状芽孢杆菌。

目录

文摘

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引言

1文献综述

2哈密瓜内生拮抗菌株的筛选及其胞外代谢物的抗菌活性测定

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.3小结与讨论

3内生拮抗菌株产生抑菌物质的初步分析

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3小结与讨论

4内生拮抗菌株197抑菌物质产生条件研究

4.1材料与方法

4.2结果与分析

4.3小结与讨论

5内生拮抗菌株197抗菌蛋白的粗提取和初步分离纯化

5.1材料与方法

5.2结果与分析

5.3小结与讨论

6内生拮抗菌株197抗菌蛋白的部分性质

6.1材料与方法

6.2结果与分析

6.3小结与讨论

7内生拮抗细菌197、194菌株的鉴定

7.1材料与方法

7.2结果与分析

7.3小结于讨论

8结论与创新点

8.1结论

8.2创新点

参考文献

附录

致 谢

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