七彩鲑精子活力调控及精液冷冻保存的研究

摘要

本文研究了在不同渗透压条件下，Na+，K+以及其组合对七彩鲑精子的激活、快速运动时间和寿命的影响；探讨了甘油、DMSO、DMF和甲醇作为冷冻保护剂对七彩鲑精子的毒性、平衡时间和冷冻保存效果。
　　 通过对精子活力的调控试验，能够观察到：第一，在温度不同的条件下，如低温4℃的时候保存精子的活力时间比高温15℃更长；第二，七彩鲑精子离体后，在2～3个小时内活力开始急剧下降；第三，七彩鲑精子在运动中的适宜渗透压为396.8Kpa～440.6kpa；第四，在适宜渗透压范围内，Na+对精子的快速运动时间和寿命时间有着显著的延长作用，其LT和FT分别为141.35±8.56s和93.43±5.88s；第五，在渗透压为228.5×10-3kPa时，K+能够极大的延长七彩鲑精子的快速运动时间和寿命时间，其LT和FT分别为90.44s、46.11s。在457.8×10-3kPa作用下，其效果基本与去离子水等同，当渗透压进一步上升时会产生抑制效果。
　　 通过对精液的冷冻试验，可以观察到：第一，在浓度为4%-19%的范围之内，DMF、DMSO及甲醇对于七彩鲑精子都具有一定的毒性，相同浓度下，甘油的毒性相对较小；第二，抗冻剂的平衡时间宜不超过60min；第三，6%～21%的甘油、3％～11%的甲醇、6%～16%的DMSO和3%～9%的DMF都能够对七彩鲑精子起到抗冻保护作用，5%-15%蔗糖并没有相似的作用；第四，将温度为5～8℃的精子以-15～-35℃/min的速率降到-196℃，对于精子活力没有显著性影响，说明七彩鲑精子对于冷冻速率有着较为广泛的适应性；第五，甘油在不同浓度下对七彩鲑精子起到的抗冻保护作用没有明显的差异，但其浓度越大对精子的毒性越大；第六，在0.5ml的麦管中保存(60μl、120μl及200μl)体积的精液，对精子的活力不造成影响：第七，将精液以10:20-1:120的比例稀释后，对解冻后的精子活力有轻微影响。综上所述，能够得出，七彩鲑精子在超低温下冷冻的最佳程序：在0.5ml麦管内的装管120μl体积精液，以17.5%浓度的甘油作为抗冻剂，将温度为5～8℃的精子以-25℃/min的冷冻速率降到-196℃，经过5min的平衡时间投入液氮罐中进行保存，在精子解冻时用温度为30℃的水浴30S。
　　 受精试验结果表明：以20%的甘油做保护剂，用0.5ml的麦管冷冻保存，七天后解冻，人工授精效果较理想。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

第1章 鱼类精液生理及冷冻保存研究进展

1.1 对鱼类精子活力做出的研究

1.1.1 鱼类精液的普遍生理特征

1.1.2 鱼类精子活力的研究进展

1.2 建立精子冷冻库

1.3 对冷冻保存对鱼类精子质量影响做出的研究

1.3.1 冷冻保存对精子形态结构的影响

1.3.2 冷冻保存对精子运动率、受精率和孵化率的影响

1.3.3 冷冻保存对精子代谢机能的影响

1.3.4 冷冻保存对精子抗氧化机能产生的影响

1.3.5 冷冻精子遗传物质损伤的研究

1.4 本研究的目的和意义

第2章 Na+、K+及其组合对七彩鲑精子活力影响的研究

2.1 材料和方法

2.1.1 采集七彩鲑雄鱼精液

2.1.2 配制稀释液

2.1.3 配制试验液

2.1.4 七彩鲑精子离体搁置活力检测

2.1.5 七彩鲑精子密度的测定

2.1.6 测定七彩鲑精子活力

2.1.7 数据处理方法

2.2 结果

2.2.1 七彩鲑新鲜精液的体外搁置试验

2.2.2 测定七彩鲑精液的密度

2.2.3 Na+对七彩鲑精子活力的影响

2.2.4 K+对七彩鲑精子活力的影响

2.2.5 Na+、K+对七彩鲑精子的共同作用

2.3 讨论

2.3.1 体外搁置对七彩鲑精子活力的影响

2.3.2 七彩鲑精液密度

2.3.3 渗透压对七彩鲑精子活力的影响

2.3.4 Na+、K+对七彩鲑精子的共同作用

第3章 超低温冷冻保存

3.1 材料和方法

3.1.1 材料采集与活力检测

3.1.2 超低温冷冻的方法

3.1.3 抗冻剂毒性筛选试验

3.1.4 不同浓度甘油对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.1.5 不同冷冻速率对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.1.6 不同抗冻剂对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.1.7 不同冷冻体积对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.1.8 不同平衡时间对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.1.9 不同解冻方法对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.1.10 不同稀释比例对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.1.11 数据处理方法

3.2 结果

3.2.1 毒性筛选试验

3.2.2 不同浓度甘油对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.2.3 不同冷冻速率对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.2.4 不同抗冻剂对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.2.5 不同冷冻体积对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.2.6 不同平衡时间对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.1.7 不同解冻方法对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.1.8 不同稀释比例对精子解冻之后的活力情况产生的影响

3.3 讨论

3.3.1 关于不同鱼类稀释液对七彩鲑精液冷冻保存的问题

3.3.2 关于抗冻剂的选择七彩鲑精液冷冻保存的问题

3.3.3 关于不同甘油浓度对七彩鲑精液冷冻保存的问题

3.3.4 关于稀释比例对七彩鲑精液冷冻保存的问题

3.3.5 关于其它因素对七彩鲑精液冷冻保存的问题

第4章 七彩鲑受精试验

4.1 试验材料

4.1.1 亲鱼的捕捞与挑选

4.1.2 试验环境

4.1.3 试剂

4.1.4 主要仪器

4.2 试验方法

4.2.1 精液稀释液的配制

4.2.2 精液的采集

4.2.3 精液的冷冻保存

4.2.4 卵子的采集与保存

4.2.5 冷冻精液的解冻和人工授精

4.2.6 受精卵的人工孵化

4.3 数据分析方法

4.4 结果

4.4.1 甘油冷冻保护剂对七彩鲑受精率的影响

4.4.2 不同冷冻管对七彩鲑精液冷冻保存效果的影响

4.5 讨论与分析

4.5.1 七彩鲑精液保护剂的筛选

4.5.2 七彩鲑精液冷冻管的筛选

4.6 结论

参考文献

致谢

作者简介