根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区基因的克隆及原核表达

摘要

对于植物基因工程而言,其中一个关键的技术环节是植物基因遗传转化技术.农杆菌(Agrobacterim)转化法是目前最有效的植物基因转化方法,但此法受寄主限制,并要求建立再生系统.该项研究建立在对农杆菌转化分子机理的深刻认识上,旨在吸取农杆菌转化的优点,通过克隆协助其T-DNA转化的关键毒性区蛋白VirD2,VirE2,VirD1的基因,构建原核表达载体,并表达出蛋白,为将来结合其他(如花粉管通道、基因枪等)常规转化方法,探索一条转化质量、效率高的转化途径奠定基础.将给植物转基因工作在科研和技术上带来极大方便.根据U.Washington发表的根癌土壤农杆菌(Agribacteriumtumefaciens)C58Ti质粒基因序列,设计三对对引物分别含NcoⅠ、SalⅠ,Hind Ⅲ、XhoⅠ,EcoⅤ、HindⅢ酶切位点,利用PCR的方法,扩增了c58根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区蛋白VirD2、VirE2、VirD1基因,连接T载体经测序与发表的序列同源性分别达100%、100%、99.5%.将VirD2、VirE2片段从T载体上切下,连接至原核表达载体PET30a上,转化E.coli DH5 α,筛选出阳性克隆,提质粒转化受体菌E.coli BL21,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳,发现与对照比较分别在近50KD、65KD处有特异条带,与理论大小(49.5KD、63.3KD)相符表明所克隆的VirD2、VirE2基因获得了原核表达.

目录

文摘

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主要符号表

第一部分主要试剂配制

第二部分实验研究

实验一根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区基因VirD2基因的克隆及原核表达

1实验技术路线

2实验材料

3实验方法

4结果与分析

实验二根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区基因VirE2基因的克隆及原核表达

1实验技术流程

2材料

3方法

4结果与分析

实验三根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区基因VirD2基因的克隆及序列测定

1实验材料

2实验方法

3结果与分析

第三部分结论与讨论

1结论

2讨论

第四部分文献综述 农杆菌转化分子机理及原核表达研究概况简介

参考文献

附录

攻读硕士期间的研究成果

致谢

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