苹果茎沟病毒的分子特性及实时荧光RT-PCR检测方法的研究

摘要

本研究在中国大陆首次报道了ASGV的完整CP基因序列，为该病毒的分子生物学检测方法的研究奠定了基础。　　分析了ASGV在果树上的潜隐感染较普遍，在果树体内浓度又很低，且一般不产生明显症状，必须采取特定的方法才能明确果树是否潜带此病毒。由于以往检测苹果茎沟病毒的指示植物法、血清学法及分子生物学方法存在不足之处，为此本研究再根据ASGV序列分析结果，找出各分离物外壳蛋白基因的保守序列，设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan-MGB探针，首次建立了ASGV的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法的检测灵敏度比常规RT-PCR电泳检测高约10倍，在25此反应体系中，Mg2+浓度为3.5mM，引物浓度为0.6μM，此方法快速、灵敏，整个检测过程完全闭管，无需PCR后处理。这为今后库尔勒香梨田间ASGV的检测提供依据，为无毒苗木生产奠定基础的结论。

目录

文摘

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前言

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第一章文献综述

1.1苹果茎沟病毒研究概况

1.1.1苹果茎沟病毒基因组、生物学特性及其危害

1.1.2苹果茎沟病毒的检测方法

1.2实时荧光PCR检测方法

1.2.1分子信标

1.2.2杂交双探针

1.2.3 TaqMan探针

1.3本论文的研究目的和意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1毒源

2.1.2分子生物学试剂

2.1.3仪器

2.1.4培养基及重要溶液的配制

2.2方法

2.2.1 KRL-1外壳蛋白全长cDNA克隆及序列分析

2.2.2 ASGV实时荧光RT-PCR一步检测法的建立

第三章结果与分析

3.1 KRL-1外壳蛋白全长cDNA克隆及序列分析

3.1.1 RT-PCR扩增结果

3.1.2 KRL-1 CP基因的克隆及序列分析

3.1.3 KRL-1与其它ASGV分离物CP基因序列的比较和分析

3.2 ASGV的实时荧光RT-PCR一步检测法的建立

3.2.1探针的设计

3.2.2探针适用性检测

3.2.3实时荧光RT-PCR检测体系优化

3.2.4实时荧光RT-PCR检测

3.2.5实时荧光RT-PCR检测的灵敏度

第四章结论与讨论

4.1从分子水平上证实了KRL-1分离物为苹果茎沟病毒

4.2建立了ASGV实时荧光RT-PCR检测的最优化体系，其灵敏度达到20pg

4.3实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR的比较

4.4 MGB-ASG探针介入的试剂盒的开发及应用前景

参考文献

附图

致谢

作者简历