脂多糖(LPS)诱导绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库的构建、EST分析和免疫相关基因的研究

摘要

脂多糖（lipopolysaccharide LPS）是革兰氏阴性细菌胞壁外膜中的一种生物活性成分，在革兰氏阴性细菌感染的发病机制中起十分重要的作用，能够刺激机体免疫系统，诱导炎症反应，而且作用于抗原提呈细胞，参与诱导抗感染的特异性免疫应答，是早期免疫应答反应的最强刺激剂。本项研究旨在构建LPS诱导的绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库，为绵羊免疫相关功能基因研究提供基础平台；监测免疫相关因子（细胞因子、TLR受体和防御素）基因对LPS刺激的应答反应规律，探讨其参与机体抗感染免疫的分子机制；通过基因工程表达相关功能基因并鉴定其生物学功能，为开发免疫佐剂和治疗性药物奠定基础。 目前，绵羊各种组织类型的cDNA文库数量还很少，可为绵羊基因组研究提供的遗传标记很有限，导致绵羊基因组物理图谱研究较其它家畜如牛、猪等研究相对滞后。绵羊功能基因的研究主要集中在经济性状相关基因，对抗感染免疫相关的因子研究很不充分，绵羊细胞因子、toll样受体和防御素的表达分布、与病原感染之间的关系以及自身之间相互调节的联系都还不清楚，其表达调控的分子机制对研究疾病的病理过程具有重要意义，有必要进行深入的研究和探讨。 本研究通过气管灌流法从绵羊肺脏分离培养原代肺泡巨噬细胞，利用台盼蓝拒染试验和鸡红细胞吞噬试验对其进行形态学观察和鉴定，运用SMART技术构建LPS诱导的绵羊肺泡巨噬细胞全长cDNA文库，随机挑选255个克隆进行序列测定，通过BLAST/n/x对序列进行比对分析，利用Sequin软件提交新发现EST或基因；应用PCR和RT-PCR技术扩增绵羊细胞因子（IL-1β，IL-8，GM-CSF，IFN-γ）、TLR受体家族、防御素sBD1和内标（G3PDH，α-Tubulin）基因，对其进行克隆和序列分析，以含有目标基因的质粒为模板建立荧光定量PCR检测方法，动态监测LPS诱导绵羊肺泡巨噬细胞过程中细胞因子、toll样受体和防御素的应答反应规律；应用RT-PCR和荧光定量PCR方法检测绵羊防御素sBD1在绵羊不同发育阶段的表达分布及表达差异。建立沙门氏菌感染绵羊消化道模型，检测防御素sBD1和IL-8对沙门氏菌感染的应答反应，对其抗感染生物学功能进行研究；构建重组绵羊GM-CSF表达质粒电击转入酵母细胞，通过甲醇诱导绵羊GM-CSF分泌表达。构建原核表达载体在大肠杆菌中融合表达绵羊防御素sBD1，并对其进行抗菌活性检测。初步获得以下结果： （1）构建了脂多糖LPS诱导的绵羊肺泡巨噬细胞全长cDNA文库，其库容量达到1.3×106，重组率为95.7％，符合cDNA文库建库标准；从255个随机克隆中发现新EST或基因45个并提交GenBank，获得登录号EU366470-EU366473，EU366475-EU366492，EU366494-EU366497，EU370534-EU370552，未知基因6个； （2）系统地阐明了在LPS刺激0～48h过程中，绵羊细胞因子（IL-1β，IL-8，GM-CSF，IFN-γ）、toll样受体家族和防御素的应答规律，即IL-1β在LPS刺激后6h达到最高值，IL-8，GM-CSF在诱导后4-12h表达水平最高，IFN-γmRNA水平高峰期在16h以后。toll样受体1、2、4、6、7、8、9、10均在肺泡巨噬细胞有表达，而toll样受体3、5则未见表达，TLR2、4在诱导后20min就达到高峰，且在整个诱导过程中维持较高水平； （3）防御素sBD1在绵羊肺泡巨噬细胞中没有表达，其主要在呼吸道和消化道组织中表达，而且是持续表达的，其在不同发育阶段消化道表达水平高低为羔羊>成年羊>胎羊。在感染沙门氏菌实验中IL-8明显升高，而防御素sBD1表达反而有所降低； （4）在毕赤酵母中诱导表达绵羊GM-CSF，其表达量占总蛋白17％；在大肠杆菌中融合表达了绵羊防御素sBD1，但未表现出抗菌活性。 以上结果表明，本研究成功地构建了脂多糖LPS诱导的绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库，该文库为国内首个绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库，从对文库克隆的序列分析来看，新的EST和未知功能的基因约占20％，丰富了绵羊基因组物理图谱的遗传标记。另外，该文库是革兰氏阴性菌主要抗原组分脂多糖刺激巨噬细胞cDNA文库，为免疫相关的功能基因研究提供了平台；绵羊几种主要细胞因子（IL-1β，IL-8，GM-CSF，IFN-γ）对脂多糖LPS刺激表现出时间和表达量的差异为阐明疾病病理状态的分子机制提供了科学依据，toll样受体3、5和防御素sBD1在脂多糖刺激肺泡巨噬细胞中并不表达，说明肺泡巨噬细胞可能并不是其表达部位，toll样受体2、4对脂多糖LPS刺激的敏感性很高，说明它们参与早期的免疫应答反应，在革兰氏阴性菌感染中发挥重要作用；防御素sBD1在粘膜系统中广泛分布，并且持续表达，表明其在粘膜天然免疫中一定发挥着重要作用，但其对沙门氏菌感染没有反应，可能是由于其并不直接参与抵抗细菌感染，而与其它类型病原感染有关，而IL-8明显参与了消化道对沙门氏菌的抗感染免疫；绵羊GM-CSF参与早期的免疫应答，并且在疫苗佐剂和治疗性药物表现出良好应用前景，本研究在酵母中表达绵羊GM-CSF为进行开发和应用提供材料；防御素sBD1在粘膜系统广泛分布，但其生物学功能却不清楚，通过大肠杆菌融合表达绵羊防御素sBD1，为其生物学功能研究奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

引言

第一章文献综述

综述一：cDNA文库构建方法及其分析研究进展

综述二：动物细胞因子和toll样受体研究进展

综述三：哺乳动物防御素的研究进展

第二章实验研究

实验一LPS诱导的绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库构建和部分EST序列分析

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论

参考文献

实验二LPS诱导绵羊肺泡巨噬细胞免疫相关基因的动态表达研究

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论

参考文献

实验三沙门氏菌感染绵羊消化道防御素sBD1和白介素8基因的应答

1材料与方法

2结果与分析

3.讨论

参考文献

实验四绵羊粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因序列分析和酵母表达

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论

参考文献

实验五.绵羊防御素sBD1在大肠杆菌中表达与活性分析

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

结论

创新点

致谢

附录

作者简介