1，25-(OH)D在大鼠抗Thy1-1.1系膜增生性肾小球肾炎模型中作用的研究

摘要

目的：1，25-（OH）2D3是维生素D3活性形式，除了具有经典的钙磷代谢作用外，还具有抗增值、抗分化，调节细胞凋亡、介导免疫反应、介导多种内分泌腺激素的分泌等作用。增殖细胞核抗原（PCNA）是一种细胞周期调节蛋白，其表达在细胞周期的G1后期出现，S期达高峰，在M及G2逐渐减退，在G0及G1早期消失，可作为评估细胞增殖状态的指标。转化生长因子-β1（TGF-β1）的主要作用是增加细胞外基质（ECM）的合成、减少ECM降解，在肾小球炎症、纤维化和硬化的整个过程中具有重要作用。Bcl-2为凋亡抑制基因，在肾小球内表达于系膜细胞，在系膜细胞的凋亡中起重要作用。本研究主要通过组织病理学观察、免疫组化、RT-PCR方法，观察活性维生素D3对系膜增生性肾小球肾炎PCNA、TGF-β1、Bcl-2表达的影响，探讨活性维生素D3对系膜增生性肾小球肾炎的作用及可能机制。 方法：1.系膜增生性肾小球肾炎（Mesangial Proliferative Glomerulonephritis，MsPGN）动物模型的建立：选取清沾级SD大鼠72只，随机分为三组：正常组、肾炎组、活性维生素D3干预组，正带对照组尾静脉一次性注射生理盐水1.5ml，肾炎组和活性维生素D3干预组大鼠经尾静脉一次性注射抗大鼠胸腺细胞免疫血清（Anti-thymocyte serum，ATS）7ml/kg，复制MsPGN模型，活性维生素D3干预组从注射抗体第一天开始给与0.5ug活性维生素D3灌胃，每天一次，直至低14天，肾炎组、对照组大鼠同时给与1mL花生油灌胃，各组大鼠分别于术后1、3、7、14天处死6只大鼠留取肾脏标本，处死前于大鼠内眦静脉采血3～5ml，离心分离血清待测。2.进行HE、MASSON、PAS染色，光镜下观察肾脏病理改变情况。3.用免疫组织化学技术检测肾小球及肾间质中PCNA、TGF-β1、Bcl-2的表达情况，分析组间及组内PCNA、TGF-β1、Bcl-2的关系，及其与肾间质损伤程度间的关系。4.用逆转录方法半定量测定PCNA mRNA在MsPGN模型中的表达量，分析其与肾间质损害程度的关系。 结果：1.采用尾静脉一次性注射ATS抗体复制MsPGN模型成功，未见大鼠死亡。2.肾组织形态学与病理学改变：与对照组比，肉眼观肾炎组大鼠肾脏水肿，增大；光镜下可见肾小球体积增大，囊腔增大，系膜区增宽，毛细血管直径减少，随着时间延长，病变程度加重，7天时最明显，可见大部分肾小球系膜区显著增宽，毛细血管闭塞，球囊粘连，肾小球硬化及纤维化，至14天时所有上述改变有所减轻；与肾炎组比，活性维生素D3干预组大鼠肾脏体积略小，水肿减轻；光镜下可见肾小球体积变小，囊腔减小，系膜区宽度变窄，毛细血管腔基本恢复正常。3.免疫组化：PCNA在对照组肾小球系膜细胞中有少量表达；在肾炎组中系膜细胞表达增高，且随时间延长，表达明显增强，组内各天数间表达有显著差异（p<0.05），呈时间依赖性，且与肾脏病变程度里正相关（r=0.741，p<0.01）；与肾炎模型组相比，活性维生素D3干预组中PCNA的表达较肾炎组明显减轻（p<0.05）。TGF-β1在正常肾小球及肾间质中仅有少量表达，肾炎组中TGF-β1的表达明显增强，随着时间延长，其表达逐渐增多，各组间及每组各天之间有显著差异（p<0.05）；活性维生素D3组表达较肾炎组显著减轻（p<0.01）；与肾脏病变程度呈正相关（r=0.522，p<0.01）。Bcl-2在正常肾小球无表达，在肾炎组肾小球中表达明显增高，随着时间延长，表达增强，各天间表达有显著差异（p<0.01）；其在活性维生素D3干预组肾小球的表达明显减少（p<0.05）；与肾小球病变程度呈正相关（r=0.381，p<0.01）。4.RT-PCR：正常组大鼠肾皮质有少量的PCNA mRNA的表达；肾炎组PCNA mRNA的表达随着时间延长，逐渐增强，各天之间有显著差异（p<0.05）；活性维生素D3组PCNA mRNA的表达较肾炎组明显减少（p<0.01）。5.PCNA、PCNA mRNA、Bcl-2、TGF-β1各指标间成正相关。 结论：1.活性维生素D3可以抑制PCNA蛋白、PCNA mRNA的表达，减少系膜细胞及其基质的增殖，延缓肾小球疾病的进展：2.活性维生素D3可以通过抑制TGF-β1的表达，延缓肾小球纤维化的发展；3.活性维生素D3可以抑制肾小球Bcl-2的表达，促进系膜细胞凋亡，抑制其增殖，从而延缓肾小球疾病的进展。4.活性维生素D3可从分子水平上抑制PCNA mRNA的表达从而抑制PCNA蛋白的表达。5.PCNA mRNA、PCNA蛋白、Bcl-2及TGF-β1彼此相互影响，促进彼此的表达，使进系膜细胞及细胞外基质的表达增多，从而促进肾小球疾病的进展。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

(Introduction)

材料与方法

1、动物模型的建立：

2、免疫组化：

3、ELISA

4、RT-PCR：

5、统计学方法：

结 果

1、活性维生素D3对系膜增生性肾小球肾炎肾脏形态及病理学的影响

2、活性维生素D3对肾小球中PCNA、TGF-β1、Bcl-2表达

3、MsPGN大鼠血清中TGF-β1的表达

4、肾组织中PCNA mRNA的表达

5、肾小球损伤程度与肾小球中PCNA、TGF-β1、Bcl-2、PCNA mRNA表达之间的关系

6、肾小球中PCNA的表达和TGF-β1、Bcl-2表达之间的关系

7、肾组织中PCNA mRNA的表达与TGF-β1、Bcl-2表达之间的关系

8、肾组织中PCNAmRNA的表达与PCNA表达之间的关系

9、肾小球中TGF-β1表达和Bcl-2表达之间的关系

讨 论

结 论

参考文献

文献综述：活性维生素D3在肾脏疾病中的应用进展

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致 谢