库尔勒香梨苹果褪绿叶斑病毒功能基因RNAi载体构建及干扰效果评价

摘要

新疆库尔勒香梨收入约占农牧民人均纯收入的35％，居农民人均收入的首位，是本地区特色支柱产业。但香梨病虫害的危害严重影响了树体健康生长，导致树势衰弱，使生产成本大大增加，严重影响香梨产量、果实品质和经济效益。苹果褪绿叶斑病毒是梨树上的最主要病毒病害之一。
　　目的：为了初步研究苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)中CP、MP基因的主要功能及其致病相关性，探究利用RNAi技术来实现抵抗植物病毒的侵染，为此构建两个干扰载体，评价其干扰效果。
　　方法：提取感病叶片的总RNA，通过RT反应合成cDNA第一条链，根据Genbank中已登录的ACLSV序列设计简并引物ACL_SP、ACL_ASP、CL_2SP、CL_ASP，通过RT-PCR反应扩增出了CP基因5'端序列377bp(PCR-CLA)和MP基因3'端序列354bp(PCR-CLB)作为靶标基因。以植物表达载体pBi35SG12为基本骨架载体，卡那霉素抗性基因为筛选基因，将靶标基因的正向序列和反向重复序列分别插入到内含子(intron)的两侧，构建RNAi载体pBi35S_CLA和pBi35S_CLB，然后利用电击转化方法将两个干扰载体转入农杆菌GV1301，利用农杆菌介导的方法转化西方烟（Nicotiana occidentalis）。在西方烟的遗传转化过程中通过改变其中单因素，分析各因素对转化效率的影响，初步建立和优化了西方烟的遗传转化体系。然后对转基因植株进行接毒实验，经过分子检测和症状观察，评价各干扰载体的干扰效果。
　　结果：在农杆菌介导的遗传转化体系中维持各激素浓度6-BA1.0mg/L，Kan100mg/L，Carb300mg/L，侵染时间10min，叶盘直径1.0cm，能明显提高西方烟的转化效率。侵染后叶盘分化产生的不定芽通过卡那霉素抗性筛选和诱导生根培养，获得了52株成功生根的pBi35S_CLA转化植株，和43株成功生根的pBi35S_CLB转化植株。提取各转化植株的基因组DNA，然后通过PCR检测pBi35S_CLA和pBi35S_CLB，结果表明分别获得27株和24株阳性转基因植株。将鉴定后的转基因烟草移栽到土壤中，继续培养到有4-6片真叶后进行汁液摩擦接毒实验。
　　结论：通过观察接毒后的转基因植株的症状和进一步的分子检测，评价各载体的干扰效果，分析各基因的主要功能，初步认为两个RNAi载体的转基因植株不能完全抵抗ACLSV的侵染，但在病毒的侵染过程中，与野生型西方烟比较，部分的转基因植株能一定程度地延缓病毒症状的发生，在后期发展中，能很大程度地降低该病毒所引起的严重危害，减轻了感病植株叶片的黄化、白化或枯死，对病毒产生了一定的干扰作用。

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中英符号缩略词表

前 言

第一章 文献综述

1.1 ACLSV生物学特性

1.2 病毒检验和脱毒

1.3 基因工程在抗病毒方面的研究概况

1.4 RNAi技术在植物抗病抗病研究中的应用

第二章 苹果褪绿叶斑病毒基因克隆及序列分析

2.1 材料与试剂

2.2 方 法

2.3 结果与分析

第三章 植物表达载体的构建

3.1 实验材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

第四章 遗传转化研究

4.1 实验材料

4.2 方法

4.3 结果与分析

第五章 RNAi载体干扰效果的初步评价

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果与分析

第六章 讨论

参考文献

附录一 PCR-CLA和PCR-CLB核苷酸序列

附录二 主要培养基、溶液配制

致谢

作 者 简 介