新疆豆制品生产环境中肉毒梭菌分离鉴定及其控制技术研究

摘要

肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽孢杆菌属，是严格厌氧菌。肉毒梭菌广泛分布于土壤、淤泥和动物粪便中，并可借助食品、农作物、水果、海产品等传播到各处，其引起的肉毒梭菌中毒死亡率高，已成为众多动物性食品和豆制品的安全隐患。本研究从豆制品加工厂附近土壤分离出一株肉毒梭菌，应用病原形态学鉴定、细菌生理生化反应及16SrDNA测序分析相结合的方法对分离出的肉毒梭菌进行鉴定；传统的肉毒梭菌检验方法具有耗时长，成本高，特异性不强等特点，本研究引入SYBR-Green Realtime-qPCR方法检测肉毒梭菌，对建立肉毒梭菌的快速灵敏检测方法进行了初步探讨；针对豆干中存在的肉毒梭菌，分别采用不同的包装方式、灭菌温度、pH值、水分含量、贮藏温度豆干其进行处理，研究其对肉毒梭菌的控制情况，同时结合Realtime-qPCR法对其进行分析；最后分别在豆制品中添加八角提取物、Nisin、亚硝酸盐、溶菌酶等，研究不同调味品和食品添加剂对肉毒梭菌的抑制效果。
　　1、豆制品生产环境中肉毒梭菌的分离鉴定
　　采集豆制品生产环境附近的土壤样品60份，分别来自菜市场、豆制品加工厂、污水沟旁草地、食品厂污水淤泥。分别在有氧和厌氧条件下，经过富集培养、分离培养，通过生理生化实验和分子生物学实验进行鉴定。
　　结果表明：在生理生化鉴定中，目标菌可分解葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖，不发酵半乳糖、甘露醇、甘露糖；石蕊牛乳培养基变蓝色，在培养后期，产生大量气体；明胶液化试验中，明胶最后呈液态，反应为阳性。采用通用引物和特异性引物对目标菌的DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测有清晰条带。所得PCR产物测序结果进行BLAST分析后，其与GenBank中A型肉毒梭菌序列相似度高达97％，将其确定为A型肉毒梭菌。
　　2、实时荧光定量法（Realtime-qPCR法）检测肉毒梭菌
　　在第一部分分离出A型肉毒梭菌的基础上，以其为目标菌进行检测，实验分为两部分。第一部分：根据前面已测定的A型肉毒梭菌的16SrDNA序列，设计合成了一对引物。用以检测的纯菌DNA标准品标准品采用两种方法制备：梯度稀释菌液后提取DNA和提取DNA后梯度稀释。经过DNA提取纯化后，采用SYBR GreenI荧光定量PCR法定量样品中的A型肉毒梭菌菌数，比较两种方法的灵敏度。第二部分：采用传统的倾注平板法对样品中的肉毒梭菌进行定量，比较Realtime-qPCR法与倾注平板法定量结果的差异和相关性。
　　结果表明：本实验设计的适合SYBR Green Realtime-qPCR扩增的引物，可以特异性扩增检测食品中肉毒梭菌目的基因，熔解曲线中呈现出了典型的熔解峰，具有很好的特异性。采用提取DNA后在进行梯度稀释的标准品制备法，误差较小，所建立的SYBR GreenI荧光定量PCR法灵敏度可达到10-7。同时，比较采用传统的倾注平板法的培养计数定量结果和SYBR Green1荧光定量PCR法定量结果无显著性差异（P>0.05）。
　　3、不同生产条件对肉毒梭菌控制技术研究
　　将豆干布菌后，分别采用不同的包装方式、灭菌温度、pH值、水分含量、贮藏温度豆干其进行处理，研究其对肉毒梭菌的控制情况，制定正交实验表，求出最佳的处理条件；同时结合Realtime-qPCR法对其进行分析。
　　结果表明：确定了最佳的处理条件为：普通包装、处理温度100℃、pH4.0、水分含量20%、贮藏温度4℃，且影响主次顺序为处理温度＞水分含量＞贮藏温度＞pH值，在最佳处理条件下进行了验证，肉毒梭菌的检出率减少了99.2%。同时，根据SYBR GreenI荧光定量PCR方法与普通培养方法检测豆制品中肉毒梭菌菌数无显著差异（P>0.05），相关性良好可用于豆制品中肉毒梭菌的检测。
　　4、不同食品添加剂和调味品对肉毒梭菌抑制效果的研究
　　NaCl的添加对肉毒梭菌的抑制效果较差，茴香精油、蒜粉、姜粉对肉毒梭菌的抑制效果较好，单独使用无法达到有效抑菌目的。茴香精油与姜粉、茴香精油与蒜粉之间存在一定的拮抗作用，而姜粉和蒜粉之间存在一定的协同作用。Nisin作为一种高效生物抑菌剂，其对肉毒梭菌的抑制效果十分明显，和其它几种调味品都存在一定的协同作用。
　　采用响应面优化分析实验，采用5因素3水平的实验。经过实验验证，使用复合抑菌剂能够有效减少肉毒梭菌的菌数，且减少各调味品和添加剂的单一用量，取得了良好的抑菌效果。

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前言

第一章 文献综述

1豆制品的生产概况

2 实时荧光定量PCR技术的研究进展

3 香辛料和Nisin的抑菌作用的研究

4 本研究的目的和意义

参考文献

第二章 新疆豆制品生产环境中肉毒梭菌的分离鉴定

1 材料和仪器

2 实验方法

3. 结果与分析

4 结论

参考文献

第三章 实时荧光定量PCR法检测肉毒梭菌的初步探讨

1 材料和仪器

2 实验方法

3 结果与分析

4 结论

参考文献

第四章 不同生产条件对肉毒梭菌控制技术研究

1 材料和仪器

2 实验方法

3. 结果与分析

4 讨论

5 结论

参考文献

第五章 不同调味品和食品添加剂对豆制品中肉毒梭菌的抑制效果研究

1 材料和仪器

2 实验方法

3 实验结果与分析

4 结论

第六章 结论与展望

1 结 论

2 创新点

3 展望

致谢

作者简介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表