捻转血矛线虫Hc38基因保守结构域的原核表达及基于RNAi的功能初步研究

摘要

捻转血矛线虫（Haemonchuscontortus）属毛圆科（Triehostrongylidae）血矛属（Haemonchus）线虫，分布较广。寄生于反刍动物第四胃和小肠，因吸血可导致宿主贫血和衰弱，引起幼龄动物，尤其是羔羊死亡，对畜收业造成极大经济损失。捻转血矛线虫病传统的防治方法是使用化学驱虫药并结合定期转场管理，但随着耐药虫株的出现和蔓延，以及严重的药物残留问题，传统的化学防治方法受到了严峻的挑战。这已经迫使人们将注意力转移到利用免疫学方法来防治该病，尤其是疫苗的开发上。
　　Hc38基因在捻转血矛线虫肠上皮微绒毛上呈高丰度表达，据推测它的表达产物是一种重要的功能蛋白。该基因表达产物的196-512位氨基酸构成的保守结构域属于功能未知的蛋白家族pf04910，该家族目前有251条蛋白序列登录在GeneBank上，它们分属于194种生物，其中的45种为人类或动物的重大血源性疫病病原或传播媒介。GeneBank公布了该抗原基因的全序列，然而其功能国内外尚无相关报道。为此，作者开展了以下研究：
　　1.捻转血矛线虫Hc38基因保守结构域的克隆、原核表达与分析
　　参照GenBank中发布的Hc38基因序列设计引物，扩增出Hc38基因的保守结构域序列，命名为HcP，将其克隆到表达载体pET32a中，并将重组表达载体转入大肠杆菌BL21中，用IPTG进行诱导表达，表达产物经免疫亲和层析柱纯化后用SDS-PAGE和Westernblot进行检测并用弗氏佐剂制成疫苗免疫小鼠，每只小鼠免疫100μg蛋白，每隔10d免疫一次，四免后采血，ELISA检测血清抗体效价。结果表明，扩增出的片段大小与预期一致，与参考序列的相似性达99.34％，说明HcP基因成功克隆，HcP基因在大肠杆菌中高效表达，表达的融合蛋白分子量约为49.4kd，且纯化后的表达产物能与感染捻转血矛线虫的山羊血清产生单一的免疫印记条带，具有良好的反应原性，纯化产物免疫小鼠4次后，血清最高效价达到了1：51200。本实验成功地克隆、表达和纯化了捻转血矛线虫HcP基因，并对其表达产物的反应原性进行了分析，通过免疫小鼠获得了效价较高的血清。
　　2.siRNA介导的捻转血矛线虫Hc38基因沉默条件的优化
　　将体外孵育的L3期幼虫分别在无血清和添加5%血清的生理盐水、PBS、EBSS（Earle’sBalancedSaltSolution）中浸泡培养72h，根据L3期幼虫的生存状态确定最佳浸泡条件，然后分别用2.5%和5%的LipofectamineTM2000进行转染，根据转染效果确定转染试剂最佳浓度，最后分别用终浓度30nM、60nM、90nM和120nM的siRNA浸泡24h、48h和72h，RealtimePCR检测干扰效果，确定siRNA最佳浓度。L3期幼虫在添加5%血清的EBSS中生存状态最好，采用终浓度50μg/ml的LipofectamineTM2000进行转染可以得到85%的转染效率，而用90nM的siRNA1浸泡72h，干扰效率可以达到80%以上。本研究对siRNA介导的捻转血矛线虫Hc38基因沉默条件进行了优化，采用优化的条件成功抑制了Hc38基因的转录。
　　3.RNAi介导的捻转血矛线虫Hc38基因功能验证
　　针对Hc38基因序列设计并合成特异性dsRNA、siRNA，通过浸泡方式分别将dsRNA、siRNA导入捻转血矛线虫感染性L3期幼虫体内，通过RNA干扰途径抑制目的基因的转录，利用实时荧光定量PCR分析Hc38基因在L3期幼虫中的抑制效果，用干扰后的虫体感染绵羊，定期采集羊粪并分离虫卵，研究排卵数和虫卵孵化率的变化，30d后宰羊取虫，研究荷虫量的变化。结果表明，各实验组中Hc38基因的相对含量显著低于对照组（P＜0.01），排卵数、虫卵孵化率及荷虫量也明显降低。本研究通过浸泡法导入的dsRNA和siRNA均能有效抑制Hc38基因的转录，并对捻转血矛线虫的生长发育产生影响，从而验证了前期对该基因功能的推测。本实验为捻转血矛线虫及其它寄生线虫的基因功能研究提供一种新的方法。

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主要英文缩写对照

第一章 文献综述

文献综述（一）捻转血矛线虫及其抗原Hc38基因研究进展

1捻转血矛线虫概述

2捻转血矛线虫抗原研究进展

3 Hc38基因研究进展

文献综述（二）RNA干扰及其在寄生线虫研究中的应用

1 RNAi的作用机制

2线虫中RNAi的特征

3 RNAi技术在线虫功能基因中的研究策略

4 RNA干扰技术在寄生线虫研究中的应用

5 结语

第二章 实验部分

实验一 捻转血矛线虫Hc38基因保守结构域的克隆、原核表达与分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

实验二 siRNA介导的捻转血矛线虫Hc38基因沉默条件的优化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 结论

实验三 RNAi介导的捻转血矛线虫Hc38基因功能验证

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 结论

创新点

参考文献

附录

常用试剂的配制

致谢

作 者 简 介