bcl-2基因CpG岛甲基化对鸡与鹌鹑属间杂交种早期胚胎发育的影响

摘要

【目的】鸡与鹌鹑属间杂交面临着受精率低和孵化率低等远缘杂交不亲和性，特别是杂交种早期胚胎大量死亡，严重影响鸡与鹌鹑属间杂交的推广应用。本研究在对鸡、鹌鹑及其杂交种胚胎样本进行性别鉴定的基础上，采用与细胞凋亡和增殖相关的bcl-2基因的启动子区CpG岛甲基化检测和荧光定量PCR验证的方法，对比分析bcl-2基因的甲基化程度和基因表达水平，以探讨bcl-2基因甲基化对鸡与鹌鹑属间杂交种早期胚胎死亡的影响作用。
　　【方法】
　　（1）用CHD基因分析鸡、鹌鹑及其杂交种性别比率采集鸡、鹌鹑及其杂交种胚胎胚龄为60h、66h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、156h、168h（7d）共11个时间点的胚胎组织样并提取基因组DNA，孵化杂交种蛋2465枚，采集胚胎样550枚（每个时间点采集50枚，共11个时间点）,通过PCR的方法选择与性别分化相关的CHD基因进行性别鉴定。
　　（2）用MSP方法对鸡、鹌鹑及其杂交种胚胎组织中bcl-2基因进行甲基化程度检测。采用甲基化特异性PCR(MSP)方法对鸡、鹌鹑及其属间杂交种早期胚胎发育至60h、66h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、156h、168h11个不同胚龄胚胎组织bcl-2基因启动子区CpG岛甲基化状态进行检测与对比分析，用甲基化引物扩增出182bp的目的片段即判定为甲基化状态，而用非甲基化引物能扩增出片段长为181bp的目的条带就说明该bcl-2基因发生了非甲基化。
　　【结果】
　　（1）杂交种蛋孵化至60h时其受精率仅能达到13.7％；当母本朝鲜鹌鹑达到其产蛋高峰期时，受精率则有所提高，孵化至156h可达35.7%，总体的平均受精率为22.3%。
　　（2）鸡和鹌鹑胚胎的各时间点雌雄比均趋近于1:1，鸡胚和鹌鹑胚的总体雌性百分率为49.697%和52.424%，与之相对应的二者的总体雄性百分率为50.303%和47.576%，雌雄比平均值比分别约为1和1.04；而杂交种胚胎性别的鉴定结果则与鸡、鹌鹑明显不同，在胚胎发育至72h-168h时平均雄性百分率为72.5%，显然远高于雌性百分率27.5%，所有时间点上的总体雌雄比率为1:4，雌性胚胎枚数有明显差异。
　　（3）正常发育的鸡胚和鹌鹑胚龄在60h、66h、72h、120h大部分样本均呈高甲基化状态，鹌鹑胚胎在96h和108h鹌鹑胚为非甲基化状态，鸡胚在96h和108h仍然为甲基化状态；而鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎在60h、66h、72h、96h、108h和120h则与鸡、鹌鹑明显不同，呈现出甲基化或非甲基化无规律性并存甚至于检测不到甲基化状态，但在84h则只检测到非甲基化状态。
　　【结论】
　　（1）杂交种早期胚胎的雌性胚胎在发育过程中出现性别分化异常而导致大批死亡。
　　（2）杂交种早期胚胎组织中bcl-2基因的甲基化呈异常状态，是影响胚胎发育进程和造成胚胎早期死亡的原因之一。

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前言

第一章 文献综述

第一节 远缘杂交

第二节 bcl-2基因的研究进展

第三节 DNA甲基化的研究进展

第二章 实验部分

第一节 鸡、鹌鹑及其杂交种性别鉴定

第二节鸡、鹌鹑及其杂交种胚胎组织中bcl-2基因甲基化检测及胚胎发育性变化

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参考文献

致谢

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