新疆石河子地区羊传染性脓疱病毒的分离鉴定及其119基因缺失株研究

摘要

本研究采集了新疆石河子地区疑似羊传染性脓疱病毒(ORFV)感染的发病山羊唇部结痂病料,通过病毒检测、分离和鉴定。以 ORFV分离株为研究对象,分别克隆了ORFV分离株主要保护性抗原基因B2L和F1L,以及3个毒力基因VIR、GIF和VGEF,并进行了测序和遗传进化分析,从分子水平上证实了ORFV石河子流行株发生了遗传变异。以ORFV-SHZ1为研究对象,通过同源重组的方法构建了ORFV119基因的缺失株,并对其滴度、生长特性和遗传稳定性进行了初步研究。本研究为新疆地区ORFV的科学防控和疫苗研发奠定了前期基础。研究方法和主要结果如下:
　　1.ORFV石河子流行株的分离鉴定
　　采集新疆石河子地区疑似羊传染性脓疱病毒(ORFV)感染的羔羊唇部结痂病料,用ORFV B2L基因特异性引物扩增,筛选出ORFV阳性病料。将ORFV阳性病料碾磨和无菌处理后,接种Veroa细胞进行病毒分离。在盲传五代后出现典型的细胞病变,经电镜负染观察在细胞培养上清液中观察到外观呈椭圆形、有囊膜、表面呈绳索样结构排列的副痘病毒粒子。超薄切片显示,细胞内有成熟的病毒粒子。用纯化病毒液划痕接种2月龄羔羊进行动物回归实验,接种后在其口角和唇部等部位出现丘疹和脓疱等ORFV感染的典型症状,证实分离出的3株病毒均为 ORFV,分别命名为 ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ2和ORFV-SHZ3。
　　2.ORFV石河子流行株重要抗原和毒力基因的克隆和遗传进化分析
　　为研究ORFV石河子流行株的遗传变异情况,对新疆石河子地区分离得到的3株ORFV的保护性抗原基因B2L和F1L,及毒力基因VIR、GIF和VEGF分别进行克隆、测序及遗传进化分析。结果显示,ORFV B2L和F1L基因与其他参考株核苷酸序列的同源性分别为97.28-98.37％和94.56-97.17%;氨基酸序列同源性分别为88.6-97.9%和86.7-97.4%,表明B2L和F1L基因相对保守。VIR、GIF和VEGF基因与其他参考株的核苷酸序列同源性分别为91.67-98.01%、88.67-96.12%和75.85-97.96%;氨基酸序列同源性分别为91.8-97.3%、85.2-97.0%和71.5-98.5%,表明毒力基因的变异相对较大,尤其是VEGF基因。基于B2L和VIR基因的遗传进化树分析表明,SHZ1和SHZ2分离株与台湾分离株亲缘关系最近;基于VEGF的遗传进化树显示3株SHZ分离株均与新西兰分离株NZ2的亲缘关系最近;基于GIF基因的遗传进化树显示SHZ分离株与印度分离株MUK59/5的亲缘关系最近。F1L基因的遗传进化树显示SHZ分离株分布于两支,分别与意大利分离株OV/C2和OV/Torino及美国分离株OV-SAOO的亲缘关系最近。研究结果提示,SHZ分离株可能由台湾株与其它毒株重组后产生,其毒力基因发生了较大的变异。
　　3.ORFV119基因缺失株的构建及鉴定研究
　　采用PCR方法扩增包含ORFV-SHZ1株119基因及侧翼序列的基因片段,用酶切方法缺失掉119基因123bp序列,在缺失位点插入带有痘苗病毒晚期启动子P11和LacZ报告基因的表达盒,构建以LacZ基因为筛选标记的重组穿梭载体。将重组穿梭载体转染ORFV感染的Vero细胞中进行同源重组,利用蓝白斑筛选方法连续5次筛选纯化重组病毒,对重组病毒鉴定并测定其滴度、生长特性和遗传稳定性。结果成功获得了119基因缺失的重组病毒ORFV-LacZ,重组病毒TCID50为1×10-4/mL,与亲本株差异不显著。重组病毒和亲本株在Vero细胞上的生长曲线相似,推测119基因可能是与ORFV毒力无关的复制非必需区。

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第一章 文献综述

1 羊传染性脓疱病流行状况

2 羊传染性脓疱病毒病原学研究

3 羊传染性脓疱病的免疫防控

第二章 实验内容实验一 羊传染性脓疱病毒石河子流行株的分离鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验二 羊传染性脓疱病毒石河子流行株部分重要抗原及毒力基因的克隆和遗传进化分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验三 羊传染性脓疱病毒119基因缺失株的构建及鉴定研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文结论

参考文献

附录

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