单核细胞增生李斯特菌InlC基因缺失株的构建及其毒力和环境耐受性的研究

摘要

单核细胞增生李斯特菌（listeria monocytogenes，LM）是一种常见的食源性致病菌，可以引起人类的李斯特菌病。此菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阳性菌，可以引起孕畜（妇）流产和脑膜炎等疾病，是对人畜具有较大危害的人兽共患病病原。LM是短小的无芽胞杆菌，常呈V字形或成对排列，属微需氧菌，对营养要求不高，在普通培养基上能生长，耐碱、耐盐、耐热。该菌生长温度一般为30-38℃，但在4℃条件下仍能生长繁殖，其最低生长温度为0.1-0.4℃。根据菌体和鞭毛抗原成分，其中致病血清型有1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b，而以4b型引起发病较多。LM是典型的胞内寄生菌，不仅可以在吞噬细胞内生长，也能在上皮细胞和肝细胞内生长，可以通过损伤的黏膜经神经末梢的鞘膜侵犯中枢神经系统。该菌编码与胞内寄生生活循环有关的毒力基因有2簇，分别为李斯特菌毒力岛1( LIPI－1)和李斯特菌毒力岛2( LIPI－2)。LIPI—1有6个基因，两侧分别为prs和ldh位点，从prs下游开始，依次为转录活化因子编码基因prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB。LIPI－2又称为内化素小岛，内化素是指一个富含亮氨酸重复序列的蛋白质家族，分为2个亚族，亚族1的代表是由InlAB基因编码的 InlA和 InlB多肽，亚族2是由相对分子质量较小(25000～30000)的蛋白质组成，原形来自 LM的 InlC。鉴于此，本研究构建了LM90SB2-△InlC基因缺失株，并开展了缺失株毒力和环境耐受性研究，探讨了LM的Inl C因子在其毒力和环境耐受性方面的调控作用，为LM弱毒疫苗的研发提供了科学依据。
　　本研究主要内容包括：⑴LM90SB2-△InlC基因缺失株的构建与分子鉴定：首先，在NCBI网站上查找出InlC基因序列，设计出用于基因缺失的上、下游同源臂引物；然后，以LM90SB2DNA为模板，利用PCR技术扩增出InlC基因两侧的上游同源臂和下游同源臂；接着运用基因重叠PCR（SOE-PCR）技术分两步将扩增出的上、下游同源臂融合，获得InlC基因缺失片段；然后将InlC基因缺失片段插入到穿梭载体PKSV7中，构建重组穿梭质粒pKSV7-△Inl C。将pKSV7-△InlC电转化到LM90SB2中，用检测引物（L1、L4）对电转后的菌株和传代培养的菌株进行PCR鉴定及测序分析。结果筛选得到可以扩增出1910bp和1026bp两条目的片段的阳性转化子；对阳性转化子在氯霉素压力41℃条件下传代培养30代，获得具有氯霉素抗性的单交换重组株；然后再在氯霉素压力41℃条件下继续传代培养至108代，得到只能扩增出1026bp一条目的片段无氯霉素抗性的双交换基因重组缺失株LM90SB2-△InlC；用新设计的旁侧引物检测只能检测到一条长度为1480bp的条带；继续在无氯霉素压力37℃条件下传代培养30代，LM90SB2-△InlC无返祖现象，说明该缺失株具有遗传稳定性。⑵LM90SB2-△InlC基因缺失株对毒力的影响：通过小鼠半数致死量（LD50）、肝、脾、脑载菌量、溶血试验、鼠脑微血管内皮细胞粘附、侵袭和胞内增殖试验分析缺失株LM90SB2-△InlC和野毒株LM90SB2在毒力上的差异。结果显示：LM90SB2-△InlC的LD50为107CFU，LM90SB2的LD50为104.5CFU，LM90SB2-△InlC的LD50是野毒株的102.5倍（P＜0.01）；在不同时间点，LM90SB2-△InlC缺失株在小鼠肝和脾内的载菌量均少于LM90SB2（P＜0.05）；溶血实验结果显示，LM90SB2-△InlC以及LM90SB2均呈现出β溶血；鼠脑微血管内皮细胞粘附、侵袭和胞内增殖实验结果显示：LM90SB2-△InlC的粘附率为2.63％，而野生株LM90SB2的黏附率为3.72%，两者相差1.09%（P＜0.01）；LM90SB2-△InlC的侵袭率为0.033%，LM90SB2的侵袭率为1.40%，野生株对MBMEC的侵袭率明显高于缺失株对MBMEC的侵袭率（P＜0.01）；在2-12h之间LM90SB2-△InlC在鼠脑微血管内皮细胞内的存活数量明显是低于LM90SB2（P＜0.05）的。结果提示InlC与LM的毒力相关。⑶LM90SB2-△InlC基因缺失株对环境耐受性的影响：为了检测缺失株在环境耐受性方面的变化，通过人工模拟不同温度，不同pH的应激环境，分析了LM90SB2-△InlC缺失株和野毒株LM90SB2在环境耐受性的差异。试验结果表明：与野毒株LM90SB2相比，LM90SB2-△InlC对温度和pH的环境应激耐受力几乎没有变化，提示在温度、pH的应激过程中可能不需要InlC的参与。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

英文缩略词表

目录

引言

第一章：文献综述单核细胞增生李斯特菌研究进展

1单核细胞增多症李斯特菌概况

2李斯特菌病

3单核细胞增多症李斯特菌毒力岛和毒力因子

4内化素

5单核细胞增多症李斯特菌致病机理

第二章：实验内容

试验一 LM InlC基因缺失株的构建及分子鉴定

1 材料

2 方法

3.结果

4 讨论

试验二 LM90SB2-△InlC对单核细胞增多症李斯特菌毒力的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨 论

试验三 LM90SB2-△InlC对单核细胞增多症李斯特菌环境耐受性的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨 论

全文结论

参考文献

致谢

附件

1.测序结果：

2.作者简介

3.发表论文

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表