中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2的多态性及单倍型与布病易感性的关联研究

摘要

目的：通过对患病和正常的中国美利奴羊不同个体的OLA-DQB1基因exon2基因进行单核苷酸多态性（SNPs）检测，并用 Haploview4.2软件构建其单倍型模块，从而分析该基因 SNP位点与布鲁氏菌病易感性的关联性，初步筛选与布病易感性相关的单倍型。本研究的目的通过借鉴人类在疾病与 HLA-DQB1多态性关系研究中的经验，应用在 OLA-DQB1基因SNPs与绵羊相关疾病的关联性分析上，可为绵羊抗病选育以及进一步研究 MHC的抗病机理打下基础，为今后开展布鲁氏菌抗性分子标记辅助选择研究提供一定参考依据，通过定位具有易感性的遗传位点从而加快分子遗传抗病育种的进程。
　　方法：⑴运用虎红平板凝集试验对408只中国美利奴羊进行羊种布鲁氏菌阴阳性血清检测，之后采用PCR-SSCP技术检测OLA-DQB1基因exon2的SNP位点，选取不同等位基因进行克隆测序，测序结果使用分子生物学软件进行比对分析，将检测到的SNPs及单氨基酸多态性(SAPs)分别与人的进行比较分析，再用PopGene1.32软件对每个SNP位点的等位基因频率和基因型频率进行差异统计分析，从而分析其与布鲁氏菌病易感性的相关性。⑵挑选出44个布鲁氏菌阳性和阴性的中国美利奴羊个体，采用 PCR产物直接测序法对OLA-DQB1基因exon2的SNPs进行检测，分析其Hardy-Weinberg是否达到平衡，并对筛选的SNPs做连锁不平衡分析，而后使用Haploview4.2和PHASE2.1对符合筛选条件的SNPs构建单倍型连锁图谱并推测可能存在的单倍型，与布病易感性进行关联分析，初步推测与布病易感性相关的单倍型。
　　结果：①利用虎红平板凝集试验检测羊种布鲁氏菌感染的阴阳性，在408个中国美利奴羊个体中检出332个布鲁氏菌感染阴性个体，其余的76个为阳性个体，布鲁氏菌感染阳性检出率为18.63％。②在中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2(270bp)的序列内共检测到43个SNPs，其中不存在插入和缺失位点，这些位点中包括41个简约信息位点和2个非信息位点，而二态性的多态位点多达35个。对其相应的氨基酸（89aa）序列进行分析，共发现了29个氨基酸多态位点，且所有突变均为有义突变。③对HLA-DQB1基因exon2的多态性进行比对分析，结果共发现了56个SNPs和34个有义SAPs。与中国美利奴羊的遗传变异位点相比，人类的SNPs和SAPs更为丰富，其中有7个SNPs位点和碱基变化均与中国美利奴羊的相同。④在43个SNPs位点中，196G/A位点的等位基因在病例-正常样本中的分布存在极显著差异(P<0.01)，其临近的211C/T变异位点的等位基因频率也具有显著差异（P<0.05）。针对所有检测的SNP位点的基因型进行关联分析，发现196 G/A这个变异位点的基因型频率在病例组和正常组中的分布存在显著差异（P<0.05）。⑤根据连锁不平衡和单倍型软件的界面提示，设置SNPs的筛选条件用于构建连锁不平衡图谱和单倍型，从检出的多态位点中共筛选出20个符合条件的SNPs。经连锁不平衡分析发现中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2存在6个LD Blocks，且每个Block中的SNPs之间存在强连锁不平衡，将其依次命名为Block1-Block6。从连锁不平衡图谱可以看出，每个LD Block内的SNPs位点数不尽相同。⑥经单倍型推测，由单倍型软件筛选到的20个SNPs位点共构建了6种单倍型，根据这些单倍型在病例组和对照组中的分布差异，发现Hap5这种单倍型在病例组和对照组中存在显著差异，具有有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：⑴分析中国美利奴羊OLA-DQB1基因的多态位点，在其exon2全长270bp内共检测到41简约信息位点和29个氨基酸多态位点，说明该序列的确存在丰富的SNPs和SAPs，这与免疫基因编码产物的多样性相一致。⑵由于绵羊与人的OLA-DQB1基因序列具有高度的同源性，因而对HLA-DQB1基因exon2的多态性进行分析，比对结果表明人类HLA-DQB1基因exon2的SNPs和SAPs均比中国美利奴羊的要丰富复杂许多。⑶将中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2检出的SNPs与布病易感性进行关联分析，结果表明196G/A和211C/T在病例组和对照组中分别存在极显著差异和显著差异，且196号位对应的基因型频率也在两个组别中出现了显著差异，从而推测它们可能与布病易感性相关，说明DQB1基因有可能参与到不同种类的抗原递呈活动中。⑷根据临近SNPs之间存在连锁不平衡的现象，关联所有符合条件的SNPs，共发现了6个连锁不平衡模块，而且每个模块中的SNPs之间存在强连锁不平衡。通过筛选出的20个SNPs构建了6种单倍型，发现Hap5这种单倍型与布病易感性呈差异显著(P<0.05)，可初步推测该单倍型与绵羊布病易感性紧密相关。

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引言

第一章 文献综述

1.1 布鲁氏菌病概述

1.1.1 布鲁氏菌的发现

1.1.2 布鲁氏菌的病原特性和种类

1.1.3 布鲁氏菌的感染机制

1.1.4 布病的诊断检测与防控措施

1.2 单核苷酸多态性研究进展

1.2.1 SNP的概述

1.2.2 SNP的筛查和检测

1.2.3 SNP的预测

1.2.4 SNP与疾病易感性的关联研究

1.3 MHC基因的研究进展

1.3.1 MHC的分子结构与分布

1.3.2 MHC的遗传特性和生物学功能

1.3.3 绵羊OLA-DQB1基因多态性

1.3.4 OLA-DQB1基因与疾病相关的研究

1.4 本研究目的及意义

第二章 中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2遗传多态性与布病易感性的关联分析

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 常规溶液及培养基的配置

2.1.3 分子生物学软件

2.1.4 试验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 布鲁氏菌阴阳性检测

2.2.2 基因组DNA提取的电泳检测

2.2.3 OLA-DQB1基因的PCR扩增

2.2.4 SSCP结果分析

2.2.5 中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2遗传多态性分析

2.2.6 OLA-DQB1基因编码产物的功能预测与分析

2.2.7 中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2的单氨基酸多态性（SAP）分析

2.2.8 OLA-DQB1基因exon2与HLA-DQB1基因exon2的SNPs比较分析

2.2.9 中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2多态性与布病易感性的相关性分析

2.3 结论

第三章 中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2单倍型与布病易感性的关联分析

3.1 材料和方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 常规溶液及培养基配制

3.1.3 主要分子生物学软件

3.1.4 实验方法

3.2 结果与讨论

3.2.1 中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2的PCR扩增结果检测

3.2.2 中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2的SNPs检测

3.2.3 中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2的连锁不平衡分析

3.2.4 中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2单倍型与布病易感性的相关性

3.3 结论

第四章 总结与展望

参考文献

致谢

作者简介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表