中草药添加剂对中国美利奴羊（新疆军垦型）肉品质和风味的影响研究

摘要

本研究设计三个中草药饲料添加剂，以中国美利奴羊（新疆军垦型）为实验动物，开展添加饲喂试验，检测常规肉品质指标、鲜味物质肌苷酸及其相关代谢物的含量、影响肉风味的脂肪酸的组成和含量，筛选出本研究中能够调节中国美利奴羊（新疆军垦型）肉品质和风味的最佳方剂；对部分肉质性状候选基因进行定量RT-PCR检测，分析心型脂肪酸结合蛋白基因（H-FABP）外显子2的单核苷酸多态性与中国美利奴羊（新疆军垦型）肉质性状的相关性，初步探讨中草药添加剂影响绵羊肉品质和风味的分子机理；建立绵羊前体脂肪细胞的体外培养模式，进行中草药方剂水提物干预，分析其对前体脂肪细胞增殖与分化的影响；最后对筛选出的中草药方剂进行安全性评价，为其今后推广、用以生产绿色无公害且风味独特的畜产品提供依据。试验主要内容和结果如下：
　　1.选用32只10月龄中国美利奴羊（新疆军垦型），随机分为4组。试验1、2和3组在基础日粮中分别添加1％方剂Ⅰ、1%方剂Ⅱ和1%方剂Ⅲ；试验4组为对照组，饲喂基础日粮；进行为期60 d的饲养试验，测定常规肉品质指标。
　　结果表明：三个自拟中草药添加剂均能不同程度的提高中国美利奴羊（新疆军垦型）背最长肌中脂肪含量和肌纤维密度，下调肌纤维直径，从而改善中国美利奴羊（新疆军垦型）肉的嫩度和多汁性，其中以方剂Ⅲ效果较为显著。
　　2.采用高效液相色谱法检测肉样中肌苷酸（IMP）及其相关代谢物三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷酸（AMP）、肌苷（INO）和次黄嘌呤（HYP）的含量。
　　结果表明：所有试验肉样中均不含ATP成分，ADP和AMP的含量亦很低，且各组数据无显著性差异；三个中草药添加剂均能不同程度的提高绵羊肉中IMP及其分解产物的含量，其中方剂Ⅲ组肉样的IMP、INO和校正肌苷酸值（IMPc）极显著的高于空白对照组，与方剂II组和方剂Ⅰ组相比亦存在显著性差异。结果提示，方剂III能通过影响肌苷酸的含量而改善中国美利奴羊（新疆军垦型）肉的鲜味。
　　3.采用气相色谱法检测肉样中脂肪酸的组成与含量，以对比混合脂肪酸甲酯标准品的相对保留时间进行定性，以各脂肪酸的峰面积相对百分含量进行定量。
　　结果表明：在各组实验肉样中共检测出14种脂肪酸，其中有4种饱和脂肪酸，5种单不饱和脂肪酸，5种多不饱和脂肪酸，含量较高的脂肪酸有油酸（C18:1n9c）、硬脂酸（C18:0）、软脂酸（C16:0）、顺-10-十七碳烯酸（C17:1），约占总脂肪酸含量的77.201~80.453%；三个中草药方剂均能不同程度的降低膻味脂肪酸和总饱和脂肪酸的含量，提高对机体健康有益的不饱和脂肪酸的含量和比例；相比之下，方剂Ⅱ在提高肉质营养价值方面较显著，方剂Ⅲ在改善羊肉膻味、平衡各脂肪酸比例方面较有优势。
　　4.以心型脂肪酸结合蛋白基因（H-FABP）、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(A-FABP)、脂蛋白脂酶基因( LPL)、激素敏感酯酶基因（HSL）、脂肪酸合成酶基因（FAS）、解偶联蛋白3基因（UCP3）为肌内脂肪（IMF）候选基因，以腺苷琥珀酸裂解酶基因（ADSL）为肌苷酸（IMP）候选基因，以钙蛋白酶I基因（Calpain I）和钙蛋白酶抑制蛋白基因（CAST）为肌肉嫩度候选基因，采用RT-PCR和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对各基因mRNA进行定量分析，探讨中草药添加剂对各基因相对表达水平的影响，结合前期肉品质、风味指标的测定结果，分析各候选基因相对表达水平与肉品质、风味性状的相关性。
　　结果表明：方剂Ⅱ可促进H-FABP、A-FABP基因表达，方剂Ⅲ可促进H-FABP、FAS、ADSL、calpain I基因表达，方剂Ⅲ可降低HSL基因表达，三个中草药方剂对LPL、UCP3、CAST基因表达均无显著影响。H-FABP、LPL、FAS基因表达与IMF呈正相关，HSL、UCP3基因表达与IMF呈负相关，A-FABP基因表达与IMF不相关。ADSL基因表达与IMP、矫正肌苷酸（IMPc）呈正相关。calpain I基因表达与肌纤维直径呈负相关，与肌纤维密度呈正相关；CAST基因表达与肌纤维直径不相关，与肌纤维密度呈负相关。结果提示，本试验所用中草药添加剂可促进生脂基因表达、抑制脂解基因表达、促进鲜味和嫩度候选基因表达，从而增加IMF和鲜味物质含量，并提高肌肉组织的嫩度，其中方剂Ⅲ作用最显著。
　　5.利用聚合酶链式反应-单链构象多态（PCR-SSCP）技术检测中国美利奴羊（新疆军垦型）心型脂肪酸结合蛋白基因（H-FABP）外显子2的单核苷酸多态性（SNPs），分析其与肌内脂肪（IMF）含量、肌纤维直径和肌纤维密度的相关性。
　　结果表明：中国美利奴羊（新疆军垦型）H-FABP基因外显子2有AA、AB和BB3种基因型， AA型和BB型在778位均发生了C缺失，939位均发生了A→G转换，BB型还在789位发生了T→C转换，该突变导致所编码氨基酸发生了缬氨酸→丙氨酸的替换；BB型为肌内脂肪（IMF）的优势基因型，与AB型相比差异显著，与AA型相比差异极显著；BB型与肌纤维直径存在负相关。结果提示，中国美利奴羊（新疆军垦型）H-FABP基因外显子2具有多态性，该基因可能是中国美利奴羊（新疆军垦型）肉质性状的主效基因，或者与控制这些性状的主效基因相连锁。
　　6.采用组织块法和单层细胞培养法对中国美利奴羊（新疆军垦型）前体脂肪细胞进行原代和传代培养，并对其进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色鉴定及脂肪含量测定；用四甲基偶氮唑盐（MTT）方法测定改善绵羊肉品质和风味的最佳方剂Ⅲ对前体脂肪细胞增殖的影响，用油红O染色法测定中草药方剂Ⅲ对细胞内脂肪积聚的影响。
　　结果表明：组织块法和单层细胞培养法均能培养出成分均一、增殖旺盛的前体脂肪细胞，单层细胞培养法更能在短期内更快获得大量细胞；中草药方剂Ⅲ可促进绵羊前体脂肪细胞的增殖和分化。
　　7.配置中草药方剂Ⅲ水煎剂，以50、75、100和150 mg/10 g体重的剂量分别给4个试验组小鼠一次灌服，连续观察14天，记录小鼠的中毒症状和死亡数，并计算半数致死量（LD50）；另取40只小鼠，随机分为2组，给药组以最大浓度（1.0 g/mL）和最大容积（0.4 mL/10 g体重）1次灌服，对照组用以等体积生理盐水，给药后连续观察14 d，检测最大给药量；另取160只小鼠，分别以高剂量（30 mg/10 g体重）、中剂量（15 mg/10 g体重）、低剂量（7.5 mg/10 g体重）灌胃给药，每天1次，连续给药30 d，对照组灌服等体积生理盐水，测定小鼠体重、血常规指标、血液生化指标和脏器系数。
　　结果表明：急性毒性试验各剂量组均无小鼠死亡，无法计算LD50，经口给药的最大剂量为400 mg/10 g体重，表明该制剂无毒。30 d喂养试验中，药物处理组小鼠血常规、血液生化指标和脏器系数与对照组相比无显著差异，肉眼观察实质器官无异常病变；各药物组小鼠体重明显增加，其中中剂量组与空白对照组相比差异显著，说明该试验药物有增加食欲，促进生长的作用。结果提示，中草药方剂Ⅲ对动物机体无毒副作用，安全可靠，可在畜牧业生产中推广应用。