马铃薯Y病毒HC-Pro与加工番茄Cab-1A-like蛋白相互作用及其相关功能研究

摘要

马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY），属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），是危害新疆加工番茄的主要病毒之一，严重影响着新疆加工番茄的产量和质量。PVY编码的辅助成分蛋白酶（helper component proteinase, HC-Pro）是一个多功能蛋白，除了自身具有的蛋白酶功能外，还参与PVY的蚜虫介导的非持久性传播、症状表达、细胞间的移动、抑制植物的RNA沉默、反式激活其他病毒等过程。病毒的致病性多依赖于病毒蛋白与寄主蛋白质因子相互作用实现，已经报道的有HC-Pro自身相互作用，HC-Pro分别与植物蛋白翻译起始因子eIF(iso)4E、乙烯-诱导的转录因子RAV2、叶绿体分裂蛋白NtMinD的相互作用等。本实验室前期通过酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2H）方法，以HC-Pro为诱饵蛋白，从加工番茄的cDNA文库中筛选到一个编码叶绿素a/b结合蛋白1A(Chlorophyll a/b-binding protein1A,Cab-1A)同源基因的克隆，并将该基因暂命名为LeCab-1A-like基因。
　　目的：本研究拟用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验进一步验证HC-Pro蛋白与加工番茄Cab-1A-like蛋白在植物体内是否存在相互作用，为更进一步研究探讨HC-Pro与该加工番茄蛋白的在番茄体内的互作机制以及为培育抗病毒加工番茄育种奠定基础。
　　方法：1.从加工番茄的cDNA文库中PCR扩增出Cab-1A基因的全长序列，目的连接T载体进行测序；2．对测序序列进行信息学分析，分别包括分子量与等电点预测、同源物的序列比对分析，以及对Cab-1A-like蛋白的一级、二级、三级结构预测分析，细胞定位、跨膜结构预测；3.分别构建YFP N-端和C-端融合YFP残基的BiFC双元表达载体与N端、C端融合GFP的亚细胞定位载体pSPYNE-35S-Cab-1A、pSPYCE-35S-Cab-1A、pSPYNE-35S-HC-Pro、pSPYCE-35S-HC-Pro、pCBGFP-Cab-1A、pSPGFP-Cab-1A；4.分别将两种亚细胞载体分别转入农杆菌后瞬时转化烟草细胞，共聚焦显微镜下观察相应荧光的分布情况；5.将含有BiFC的YFP-N端质粒的侵染液分别与含有相应的YFP-C端的BiFC载体的农杆菌侵染液等体积混合，共侵染瞬时转化烟草表皮细胞，激光共聚焦显微镜下观察黄色荧光的分布情况；6.培养加工番茄植株幼苗，叶盘法分别转化 BiFC互作载体，激光共聚焦显微镜下观察相应的荧光的分布情况。
　　结果与分析：1.克隆的cab-1a-like基因ORF测序结果为798bp，预测可以编码一个265个氨基酸的多肽序列，加工番茄cab-1a具有叶绿素a/b结合蛋白家族domain，属于该家族成员，而且N端有一个潜在的叶绿体信号肽，预测编码的Cab-1a蛋白分子量大约是28.07KDa，PI（等电点）为5.51,该多肽92.1％的序列是保守的。对Cab-1A二级结构预测表明，可能存在3个跨膜螺旋，该序列35.09%为α-螺旋,8.68%为β-片层，56.2%序列为无规卷曲结构；2.瞬时转化pSPYCE-35S-HC-Pro/pSPYNE-35S-Cab-1A的烟草细胞中可观察到细胞核中有较强的黄色荧光存在，说明HC-Pro与Cab-1A可能存在相互作用；3.瞬时转化了C端融合GFP的pSPGFP-Cab-1A的烟草细胞中2d后，观察的荧光在细胞质中；4.叶盘法遗传转化BiFC载体，获取转pSPYNE-Cab-1A转基因植株1株、pSPYCE-Cab-1A转基因植株2株、转pSPYCE-HC-Pro1株。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

主要中文缩略符号表

前言

第一部分 文献综述

1.1 PVY的基因组结构与功能

1.2 HC-Pro 研究进展

1.2.1 蚜传活性

1.2.2 蛋白酶活性

1.2.3 参与病毒复制和症状表达

1.2.4 影响病毒细胞间和长距离移动

1.2.5 抑制植物的基因沉默

1.2.6 HC-Pro与寄主蛋白的互作

1.3 叶绿素结合蛋白Cab的研究进展

1.4 蛋白质相互作用的研究方法

1.4.1 酵母双杂交系统

1.4.2 GST融合蛋白沉降技术

1.4.3 串联亲和纯化（TAP）

1.4.4 荧光能量共振转移

1.4.5 噬菌体展示

1.4.6 免疫共沉淀

1.4.7 双分子荧光互补

第二部分 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 本实验所用的菌株和质粒载体

2.1.2 常用试剂药品及试剂盒

2.1.3 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 目的基因的扩增

2.2.2 目的基因生物信息学分析

2.2.3 亚细胞定位载体pSPGFP:35S骨架的构建

2.2.4 亚细胞定位载体pSPGFP-Cab-1A的构建

2.2.5 表达载体电击转化农杆菌GV3101

2.2.6 表达载体在烟草细胞中的瞬时表达

2.2.7 农杆菌GV3101叶盘法遗传转化加工番茄

2.2.8 激光共聚焦观察

第三部分 结果与分析

3.1 Cab-1A基因的扩增

3.2 生物信息学分析

3.2.1 Cab蛋白同源序列比对

3.2.2 cab-1a结构预测分析

3.3 表达载体的酶切鉴定

3.3.1 pSPYNE-35S-Cab-1A和pSPYCE-35S-Cab-1A载体的酶切鉴定

3.3.2 HC-Pro的BiFC载体酶切鉴定

3.3.3 pCBGFP-Cab-1A、pSPGFP-Cab-1A载体的酶切鉴定

3.4 农杆菌转化子鉴定

3.5 BiFC载体、亚细胞定位载体瞬时转化

3.5.1 BiFC载体瞬时转化烟草细胞

3.5.2 Cab-1A的亚细胞定位

3.5.3 BiFC载体叶盘法转化番茄

第四部分 讨论

参考文献

附录

致谢

作者简介

导师评阅表