新型结核病疫苗菌株的免疫保护效力和安全性研究

摘要

目的：本实验拟对本课题组利用原生质体融合技术以卡介苗（BCG）和结核分枝杆菌国际标准无毒株（H37Ra）为亲本菌株所构建的新型结核病疫苗融合菌株（B/R菌株）的免疫保护效力和安全性进行初步研究。
　　方法：对B/R菌株的免疫保护效力和安全性的研究分别从动物实验和细胞实验两部分进行。（1）动物实验：将204只C57BL/6小鼠随机分为四组：生理盐水组（36只）、BCG组（56只）、B/R组（56只）、H37Ra组（56只），分别皮内接种无菌生理盐水0.1 ml，BCG菌悬液0.1 ml、B/R菌株菌悬液0.1 ml、H37Ra菌株菌悬液0.1 ml（含活菌数为1×106个）。a：观察接种后各组小鼠一般生存状况及生存率，记录接种后第3、6、9、12、15、18周小鼠体重数值。b:分别于接种后第2、3、6、9、12周时随机抓取BCG组、B/R组、H37Ra组小鼠各4只脱颈处死后，摘取小鼠完整肺脏、脾脏；制成脏器组织匀浆并接种于改良罗氏培养基上，37℃细菌恒温培养箱内培养20天后计菌落数(CFU)。c:分别于免疫后第3、6、9、12、15、18周，随机抓取生理盐水组、BCG组、B/R组、H37Ra组小鼠各6只脱颈处死后称重；其中第3、6、9周小鼠处死前摘眼球取外周血分离血浆，用ELISA法测小鼠血浆中白细胞介素2（IL-2）及γ干扰素（IFN-γ）的水平；将处死后的小鼠打开胸腔、腹腔取肺脏、肝脏及脾脏于组织固定液中固定48小时（脾脏取出后称重并记录）制作病理切片行HE染色，观察各组小鼠肺脏、肝脏、脾脏在各时间点的病理变化情况。d:根据所记录的各组小鼠体重和脾脏重量计算各组小鼠各时间点的脾脏系数。（2）细胞实验：a:复苏并培养巨噬细胞株RAW264.7，选择状态良好的细胞，分别用BCG、B/R、H37Ra菌株菌悬液感染细胞，利用Annexin V-FITC／PI双染法分别检测感染后第6小时、12小时、24小时各组细胞的凋亡率。b:提取收集正常C57BL/6小鼠腹腔原代巨噬细胞体外培养，分别用 CG、B/R、H37Ra菌株的菌悬液感染所培养的小鼠腹腔巨噬细胞，并在感染后第0、48、96小时用1％TritonX-100裂解液裂解巨噬细胞，将裂解得到的液体稀释1000倍后取适量接种于罗氏培养基上，37℃细菌恒温培养箱内培养20天后计菌落数。
　　结果:(1）四组小鼠接种后第3、6、9、12、15、18周均无小鼠死亡，一般生存状态良好，四组小鼠生存率均为100%；所有观察时间点B/R组小鼠体重与生理盐水组相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。（2）小鼠脏器菌落计数实验发现B/R菌株、BCG及H37Ra菌株均可在小鼠脾脏、肺脏内定植生长，B/R菌株在小鼠脾脏、肺脏内的定植力较BCG强，较H37Ra稍弱；差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）小鼠接种后第3周、6周、9周时血浆中IL-2及IFN-γ的水平，B/R组较BCG组高，较H37Ra组低，差异有统计学意义（P＜0.05）。（4）小鼠接种后，BCG组、H37Ra组及B/R组小鼠肺脏均表现出不同程度的炎细胞浸润和气道上皮细胞局部脱失，肺泡间隔增宽等改变；肝脏均有不同程度的肝窦扩张淤血，汇管区炎细胞浸润，小叶间肝细胞水样变、坏死等改变，其中 BCG组与H37Ra组程度相当，B/R组病理改变程度较两者稍轻。小鼠接种后，BCG组、H37Ra组及B/R组小鼠脾脏均有不同程度白髓比例升高，淋巴小结体积增大；红髓区扩张淤血，可见多形核细胞及巨噬细胞增多等改变，其中H37Ra组及B/R组程度相当，二者均较BCG组改变明显。（5）小鼠接种后第3、6、9、12周时小鼠脾脏系数，B/R组与生理盐水组相比显著升高；差异有统计学意义（P＜0.05）；所有观察时间点B/R组分别与H37Ra组、BCG组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。(6)细胞凋亡实验提示BCG、B/R与H37Ra组均可诱导巨噬细胞株RAW264.7凋亡增加，B/R菌株诱导巨噬细胞凋亡能力与 BCG无异；较 H37Ra菌株增强，其差异有统计学意义（P＜0.05）。（7）巨噬细胞内增殖实验发现BCG、B/R菌株、H37Ra菌株均可在小鼠腹腔巨噬细胞中生存繁殖，B/R菌株在小鼠腹腔巨噬细胞内的增殖能力与BCG相比无明显差异；与H37Ra组相比降低，其差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：1.B/R菌株接种C57BL/6小鼠后不影响小鼠一般生长发育及生存时间。2.B/R菌株在C57BL/6小鼠体内至少定植3个月，其定植力较BCG增强，较H37Ra菌株弱。3.B/R菌株在C57BL/6小鼠体内诱导细胞免疫应答水平较BCG显著增强，较H37Ra菌株弱。4.细胞实验结果表明B/R菌株的毒力与BCG无显著差异，与H37Ra菌株相比明显减弱。

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中英文缩略词对照表

前言

材 料 和 方 法

1材料

1.1菌株

1.2 实验动物

2.主要试剂及溶液配制

2.1 主要试剂

2.2 主要溶液的配制

2.3改良罗氏培养基的配制

3.主要仪器设备

4.实验方法

4.1结核分枝杆菌的培养

4.2 结核分枝杆菌菌悬液免疫接种小鼠

4.3检测指标

4.4小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞的培养

4.5细菌感染巨噬细胞

4.6统计学分析

结果

1.结核菌株的培养

2.结核分枝杆菌感染C57BL/6小鼠

2.1免疫后各组小鼠生存状态及生存率的观察

2.2各菌株对小鼠体重变化的影响

2.3接种后各菌株在C57BL/6小鼠脾脏、肺脏内的定植情况

2.4 接种后四组小鼠外周血IL-2、IFN-γ的水平

2.5接种后各组小鼠脾脏、肝脏及肺脏的病理改变

2.6各菌株对小鼠脾脏系数的影响

3.结核分枝杆菌感染巨噬细胞：

3.1巨噬细胞凋亡结果：

3.2 RAW264.7细胞凋亡结果

3.3小鼠腹腔原代巨噬细胞的培养

3.4巨噬细胞内各菌株的增殖力：

讨论

一、 B/R菌株的动物水平研究：

二、B/R菌株的细胞水平研究

结论

参考文献

文献综述: 结核病免疫机制及疫苗研究最新进展

致谢

作 者 简 介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表