运用CRISPR/Cas系统在大肠杆菌中异源表达希瓦氏菌脂肪酸代谢相关基因及其对脂肪酸代谢的影响

摘要

大肠杆菌是一个遗传背景清楚，遗传操作手段已经很成熟的模式菌株，而且到目前为止工程化大肠杆菌已经进行了很深入的研究。而这其中工程改造脂肪酸途径极大的吸引着研究者们的眼球，因为脂肪酸作为细胞膜的组成部分，对生物体具有重要的生理意义，同时也与我们日常生活息息相关。因此在大肠杆菌体内构建脂肪酸生产的工程菌株具有重要的意义和应用价值。
　　CRISPR/Cas是目前基因编辑的一个重要以及新兴技术，利用该技术国内外研究人员已经开始在多个物种，多种方面应用该技术。本论文旨在以大肠杆菌作为研究对象，构建CRISPR/Cas这个基因编辑系统，对大肠杆菌与脂肪酸代谢相关基因进行改造，并引入富油脂海洋细菌(冷海希瓦氏菌)中与脂肪酸代谢相关基因在大肠杆菌中进行表达，初步探索该系统在大肠杆菌中的应用，通过改造脂肪酸代谢途径来提高脂肪酸含量。据此本实验得出如下实验结论：
　　（1）利用http://spot.colorado.edu/~slin/cas9.html设计出了用于基因编辑的spacer，然后利用重叠PCR将该序列构建进能在大肠杆菌中高效表达的CRISPR/Cas系统的载体中，获得了在大肠杆菌中发挥作用的CRISPR/Cas系统载体。紧接着利用重叠PCR成功克隆出对应的donor，最后利用电转的方法将donor与CRISPR/Cas系统载体成功的导入宿主大肠杆菌中。
　　（2）成功构建了ΔPEPC分，ΔPEPC，ΔPEPC分-ΔFadD，ΔPEPC-ΔFadD以及ΔFadD突变体菌株，同时也成功克隆到了冷海希瓦氏菌的fadR，delta-9 desaturase和acc基因，并将这些基因分别或者串联敲入到大肠杆菌基因组中，成功获得了ΔPEPC::F/D，ΔPEPC::ACC以及ΔFadD::F/D和ΔFadD:ACC突变体菌株。
　　（3）针对于ΔPEPC分，ΔPEPC，ΔPEPC分-ΔFadD，ΔPEPC-ΔFadD以及ΔFadD突变体菌株，采用气相色谱-质谱(GC-MS)对脂肪酸进行定性及定量分析其脂肪酸含量均比野生型要高，最高的增长了3.7％，但是敲出pepc基因获得的总脂肪酸增长量并没有预期的高，同时针对ΔDPEPC::F/D，ΔDPEPC::ACC以及ΔFadD::F/D和ΔFadD:ACC突变体菌株，与野生型相比，最高的菌株脂肪酸含量达到了13.1%，几乎比野生型增长了5.3%。但是在脂肪酸组成山与野生型相比没有任何变化，都含有1:0，12:0，13:0，14:0，15:0，16:0，17:1，17:0，18:0，并且16:0，17:0，18:0占主要组成部分，这与预期的可以获得不饱和脂肪酸的理论有些偏差。

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第一章 文献综述

1.1 脂肪酸介绍

1.2 大肠杆菌脂肪酸代谢的概述

1.3 工程化构建游离脂肪酸产量目前的状况

1.4 转录调节因子（FadR）概述

1.5 ACC的结构和功能

1.6多不饱和脂肪酸概述

1.7 产PUFA海洋细菌

1.8 希瓦氏菌中与脂肪酸合成相关的基因和途径

1.9 CRISPR/Cas系统概述

1.10 CRISPR-Cas系统提供一个适应性免疫

1.11 CRISPR/Cas9在基因组编辑上的应用

1.12 CRISPR/Cas9的靶点特异性

1.13 双切口和嵌合的FokI-dCas9策略来达到高度特异性的基因组编辑

1.14 基于网页软件的特异性gRNA设计和脱靶的预测

1.15 CRISPR/Cas9载体的构建

1.16 CRISPR免疫的前景

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 CRISPR/Cas质粒构建及转化

第三章 结果与讨论

3.1 基因缺失菌株的构建结果

3.2缺失体及野生型菌株生长情况

3.3突变体菌株的脂肪酸定性及定量

3.4 克隆和鉴定来自冷海希瓦氏菌的基因

3.5 定量以及定性分析大肠杆菌中的脂肪酸

3.6讨论

第四章 前景与展望

4.1 提高输出率

4.2 调节膜饱和度

4.3 处理代谢瓶颈和调节瓶颈

4.4 结构、生化和基因研究

参考文献

致谢

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