CRISPRi、sRNAs和CRISPRi-sRNAs技术在奥奈达希瓦氏菌MR-1中的开发应用

摘要

产电菌利用胞外电子传递（EET）途径与周围环境交换电子和能量。奥奈达希瓦氏菌MR-1是一种被研究人员广泛研究的模式产电菌株，且其基因组序列已被完整测序，而其胞外电子传递（EET）途径也成为研究希瓦氏菌MR-1的重中之重。奥奈达希瓦氏菌MR-1的胞外电子传递途径（EET）是多种微生物电催化过程的基础，例如微生物燃料电池、微生物电解池和微生物电合成。不幸的是，由于在奥奈达希瓦氏菌 MR-1中缺乏有效的用于调控基因表达水平的基因组调控工具，所以仍然难以通过调节目标基因的表达水平来调控菌株的胞外电子传递（EET）效率。 CRISPRi和sRNAs是两种用于调控基因表达水平的分子操作技术，并且已被运用在多种微生物中。CRISPRi技术通过抑制目标基因的转录来对目标基因的表达水平进行调控，而sRNAs技术通过抑制目标基因所转录的mRNA的翻译来对目标基因的表达水平进行调控。 本文首先以绿色荧光蛋白（gfp）为目标基因，在奥奈达希瓦氏菌MR-1中开发CRISPRi技术，并以sgRNA与目标基因的碱基配对区域的长度、靶向位置及错配个数为变量，系统的研究了sgRNA碱基配对区的序列对CRISPRi抑制效果的影响。然后，我们将希瓦氏菌MR-1的胞外电子传递路径中的mtrA、mtrB和mtrC以及影响生物膜形成的speF和uvrY作为目标基因，利用CRISPRi来调控单个或多个目标基因的表达，进而调控菌株的胞外电子传递（EET）效率。随后，我们以gfp和mtrA为目标基因，在奥奈达希瓦氏菌MR-1中将sRNAs技术开发应用。最后，我们以mtrA为目标基因，在奥奈达希瓦氏菌MR-1中建立了可以同时调控目标基因的转录和翻译的CRISPRi-sRNAs技术，该技术将CRISPRi和sRNAs技术同时运用,可以更大程度的调控菌株的胞外电子传递能力。这种CRISPRi-sRNAs协同调控基因表达技术将成为调节EET效率和其它代谢路径的有力工具。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 奥奈达希瓦氏菌（S. oneidensis）MR-1

1.2 基因表达调控技术

1.3 本文的选题背景和研究内容

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 基因工程操作方法

2.3 菌株绿色荧光蛋白表达量的测定

2.4 MFCs的组装、表征测定及目的基因表达量的测定

第3章 S. oneidensis MR-1中CRISPRi系统的构建

3.1 CRISPRi质粒和CRISPRi-GFP质粒的构建

3.2 CRISPRi技术的构建和系统验证

3.3 小结

第4章 运用CRISPRi技术调控S. oneidensis MR-1的胞外电子传递效率

4.1 运用CRISPRi技术降低S. oneidensis MR-1的胞外电子传递能力

4.2 运用CRISPRi技术提高S. oneidensis MR-1的胞外电子传递能力

4.3 小结

第5章 S. oneidensis MR-1中sRNAs系统的建立

5.1 sRNAs质粒和sRNAs-GFP质粒的构建

5.2 sRNAs技术的构建和系统验证

5.3 小结

第6章 S. onediensis MR-1中CRISPRi-sRNAs系统的构建

6.1 CRISPRi-sRNAs菌株的构建

6.2 CRISPRi-sRNAs系统的验证

6.3 小结

第7章 结论与展望

7.1 结论

7.2 展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

致谢