一定纯度中药复方多糖对不同MHC B-LβII基因型鸡免疫调节作用受体TLR2、TLR4及免疫信号分子的研究

摘要

本研究采用前期获得的免疫增强效果显著的一定纯度中药复方多糖（中药多糖含量为77.1％），在体外条件下作用于不同MHC B-LβII基因型鸡外周血淋巴细胞，确定中药复方多糖免疫调节剂量是否受MHC B-LβII基因多态性的影响，明确中药复方多糖免疫调节作用受体，研究其发挥免疫调节作用的细胞信号分子。为该中药复方多糖开发成免疫增强剂提供理论依据。
　　方法：
　　1.采用PCR-SSCP技术对500羽新疆黄麻鸡进行MHC B-LβII基因分型，将各试验鸡按照不同MHC B-LβII基因型分组，分离各基因型鸡外周血淋巴细胞不同浓度一定纯度中药复方多糖体外共培养24h，采用Real-time PCR法检测淋巴细胞中MHC B-LβII mRNA的表达量。
　　2.采集不同MHC B-LβII基因型鸡外周血分离淋巴细胞，分别与终浓度为0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL的TLR2、TLR4抗体共培养1h后，分别加入终浓度为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、0μg/mL的一定纯度中药复方多糖共培养24h，采用ELISA法检测各MHC B-LβII基因型鸡外周血淋巴细胞培养上清中IL-6、TNF-α和NF-κB含量。
　　3.采集鸡外周血，分离淋巴细胞，分别加入终浓度为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL和0μg/mL的一定纯度中药复方多糖共培养1h、2h、4h，采用ELISA法检测淋巴细胞上清中cAMP和cGMP的含量变化。24h时，采用ELISA检测淋巴细胞上清中Ca2+、NO、iNOS含量。
　　结果：
　　1.MHC B-LβII基因第2外显子经酶切后发现了4种等位基因和5种基因型。AA、AB基因型个体在数量上多于BB、AC、AD基因型个体。在中药复方多糖组和对照组中，AA、AB基因型MHC B-LβII mRNA表达量水平均高于BB、AC、AD基因型个体。
　　2.各基因型鸡淋巴细胞仅与多糖处理时，其分泌细胞因子IL-6、TNF-α、NF-κB水平相比对照组显著升高（P<0.05）；当与TLR2、TLR4抗体孵育后再与多糖共培养时，中药复方多糖促进淋巴细胞分泌IL-6、TNF-α和NF-κB受到抑制，且随着抗体浓度的增加，抑制作用增强。
　　3.多糖组与对照组相比，均显著提高细胞培养上清中的cAMP、cGMP的水平（P<0.05）。但培养时间不同，其分泌量有差异。与对照组相比，多糖组同样能促进细胞分泌Ca2+、NO、iNOS的水平，各因子分泌量最高时对应的多糖浓度不同。
　　结论：
　　1.MHC B-LβII基因多态性所引起的个体差异在一定程度上影响中药复方多糖最适免疫增强剂量。
　　2.中药复方多糖在机体发挥免疫调节作用是通过cCHMPS与淋巴细胞表面TLR2/TLR4结合，经TLRs/NF-κB信号通路活化转录因子 NF-κB，调控细胞因子IL-6、TNF-α的合成，促进IL-6、TNF-α、Ca2+、NO、iNOS等细胞因子的分泌，启动机体免疫细胞信号通路从而发挥免疫调节作用。