布鲁氏菌16M经ROS通路介导AIR抑制细胞自噬调控炎性小体的机制研究

摘要

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一类自然疫源性人兽共患病，在世界范围内广泛流行，尤其是发展中国家，近几年回升势头迅猛。布鲁氏菌主要毒力表现在能侵入宿主细胞并在其中生存增殖形成持续性感染的能力。自噬与布鲁氏菌胞内寄生机制密切相关，目前，有研究表明膜融合相关蛋白 TECPR1的结构域 AIR在自噬发生过程中起着重要作用，但在布鲁氏菌诱导的自噬过程中该蛋白的作用机制尚未明确。活性氧(ROS)在自噬、炎症以及凋亡的发生过程中都起着重要作用。布鲁氏菌侵染巨噬细胞后能够引发巨噬细胞自噬、炎症以及凋亡，但是其具体的影响机制、是否与 ROS通路有关目前尚未明确。本研究全面探索布鲁氏菌感染引发的炎症、自噬以及凋亡反应是否与AIR结构域、ROS通路有关，为药物和疫苗的研发奠定一定的理论基础。
　　目的：本研究分别构建 AIR结构域沉默(I-A)、过表达(O-A)、干扰后回补(OA-IA)的稳定细胞株，并建立羊种布鲁氏菌标准株16M(16M)侵染巨噬细胞模型，研究16M侵染巨噬细胞后：①巨噬细胞炎症、自噬以及凋亡的发生是否通过 ROS这一通路，及ROS在巨噬细胞发生炎症、自噬以及凋亡过程中所起的作用；② AIR结构域对巨噬细胞发生炎症、自噬与凋亡时所起的作用；③AIR结构域与ROS相互作用的关系。进一步揭示布鲁氏菌在巨噬细胞内持续性感染的分子机制，为药物和疫苗研发、疾病防控、家畜抗病育种等奠定理论基础。
　　方法：通过慢病毒包装的方法，对 AIR基因进行沉默(I-A)、过表达(O-A)、干扰后回补(OA-IA)后构建稳定的细胞系，并建立16M侵染细胞模型。在未处理组和NAC( ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)预处理组中的不同时间(0、3、6、12和24 h)段，采用激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜、多功能酶标仪、荧光定量 PCR、ELISA及Western blot等方法检测与细胞炎症、自噬以及凋亡相关蛋白表达水平，ROS的产生水平以及线粒体的分布情况。
　　结果：⑴成功构建AIR干扰、过表达载体，并获得AIR干扰、过表达及回复的稳定细胞系；⑵16M能以时间依赖性方式诱导RAW264.7细胞产生ROS，干扰AIR后有利于ROS的产生。I-A组和O-A组线粒体发生异常集聚。16M侵染细胞6 h后，实验组中炎性小体相关蛋白ASC、Caspase-1、NLRP3、AIM2的表达量均显著下降。ELISA检测结果显示，与对照组相比，I-A组在侵染12 h时可导致炎性因子IL-18高表达(P＜0.05)；O-A组在侵染6、12 h时可导致炎性因子IL-1β高表达，且差异显著。NAC预处理的实验组中ROS的产生显著降低；I-A组中，NLRP3/AIM2炎症复合体相关成份和炎性因子的表达显著升高；⑶自噬结果：激光共聚焦结果显示16M侵染后细胞内出现了GFP-LC3点状聚集。与对照组相比，I-A组、O-A组和OA-IA组中线粒体出现异常集聚。qRT-PCR结果显示，与对照组相比，I-A组中LC3B/A在16M侵染6 h时表达量最高；I-A组和O-A组中16M侵染6 h时p62的表达被显著抑制。NAC预处理后，I-A组中LC3B/A显著升高；I-A组中p62在16M侵染6 h时表达显著性升高。Western blot检测结果：16M侵染6 h时，I-A组中p62蛋白表达量显著低于对照组。NAC预处理后，I-A组中p62蛋白表达量显著高于对照组。⑷流式细胞仪检测显示16M侵染后细胞凋亡率显著升高，细胞凋亡率与侵染时间呈正相关。NAC预处理后，细胞凋亡率显著下降。与对照组相比，16M侵染6 h后，FITC/PI染色后绿染和红染的细胞增多；NAC预处理后，绿染和红染细胞数均显著减少，且凋亡细胞形态发生明显改变。16M侵染6 h后，16M能够刺激Bax/Bcl-2显著性的高表达；NAC预处理后，16M侵染6 h后各实验组中Bax/Bcl-2的表达均显著降低。Western blot显示Caspase-3在蛋白水平上表达显著升高；NAC预处理后，Caspase-3在蛋白水平上表达显著降低。
　　结论：⑴干扰和过表达AIR后，ROS释放量发生显著变化，且线粒体出现异常集聚。AIR与炎性小体的活化、炎症的发生密切相关。16M通过 ROS途径激活NLRP3/AIM2炎症复合体诱导RAW264.7细胞分泌IL-1β和IL-18；⑵干扰AIR后，细胞内线粒体出现异常集聚，引起自噬相关基因表达量发生改变，提高了细胞自噬活性。NAC预处理细胞后，在16M侵染6 h时，I-A组抑制了细胞自噬的活性；NAC通过抑制ROS的产生从而抑制了细胞自噬的发生；⑶16M能够通过ROS途径诱导细胞发生凋亡；⑷16M侵染后，ROS可引起细胞发生凋亡、炎症和自噬。AIR可以抑制自噬小体成熟和自噬的发生。自噬负调控炎症小体激活，并抑制炎症反应的发生；线粒体自噬可促进细胞的凋亡。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

缩略语

引言

第一章 文献综述布鲁氏菌致病的分子机制研究

1 布鲁氏菌的胞内生存机制

2 布鲁氏菌与炎症反应

3 布鲁氏菌与自噬反应

4 布鲁氏菌与凋亡反应

第二章 实验研究

实验一 AIR干扰、过表达和回复细胞系的构建与鉴定

实验二 初步探究AIR对布鲁氏菌感染引发炎症反应的影响

实验三 初步探究AIR对由布鲁氏菌感染引发的自噬的影响

实验四 初步探究AIR对布鲁氏菌感染引发凋亡的影响

全文总结

创新点

参考文献

致谢

作者简介

导师评阅表