绵羊MHC-DQB2单倍型的构建及其与布鲁氏菌病易感性相关分析

摘要

目的：
　　通过对布鲁氏菌感染阳性组和阴性组哈萨克羊MHC-DQB2 exon2、exon3 SNP进行研究，并运用SHEsis软件对SNPs进行单倍型分析，以期得到两组个体间有显著差异的SNPs位点以及单倍型组合，以此作为与布鲁氏菌病易感性相关的遗传标记，为今后开展布鲁氏菌分子标记辅助选择研究提供一定的参考依据，为加快选育具有布鲁氏菌病抗性的绵羊新品种打下一定基础。
　　方法：
　　1.用虎红平板凝集实验对100只哈萨克羊进行血清布鲁氏菌检测，对布病感染阳性组和感染阴性组分别使用PCR-SSCP技术检测MHC-DQB2 exon2、exon3的SNPs，对具有不同基因型的个体进行克隆测序，然后运用序列比对软件寻找exon2、exon3 SNPs位点，通过统计分析，比较在布病感染阳性组和阴性组之间存在显著差异的位点，最终得出与布鲁氏菌病易感性相关的SNPs位点。
　　2通过对检测到的所有的SNPs位点进行最小等位基因频率及Hardy-Weinberg平衡的吻合度检验，选出符合条件的SNPs位点，运用SHEsis在线软件对符合要求的SNPs进行单倍型分析，得到与布鲁氏菌病易感性相关的单倍型组合。
　　结果：
　　1.利用虎红平板凝集实验对100只哈萨克羊血清样本进行了布鲁氏菌感染检测，其中检出阳性血清样本16只，阴性血清样本84只，布病感染阳性率为16％。
　　2.使用PCR-SSCP实验结果与测序结果结合分析，在哈萨克羊MHC-DQB2基因exon2270bp中检测出44个SNPs位点；在exon3282 bp中检测得到22个SNPs位点。
　　3.对哈萨克羊MHC-DQB2基因进行SAP分析，得到exon2共编码90个氨基酸，其中有34个是SAPs位点；在34个SAPs位点中，有3个为同义突变位点，其余31个均为错义突变位点。得到exon3共编码93个氨基酸，其中有20个为SAPs位点。在20个SAPs位点中，有6个为错义突变位点，其余均为同义突变位点。
　　4.通过对MHC-DQB2基因两个外显子SNP与布鲁氏菌病的关联分析，发现exon2只有9C/G位点基因频率在两组当中呈现出显著差异；通过对 exon2每个 SNP位点的基因型频率进行分析，发现9G/C、117G/T、131C/G、157C/A、180G/A5个位点在阳性组和阴性组之间存在显著差异（P＜0.05）。exon3155T/C的等位基因在两组样本中的分布存在显著差异（P<0.05）；对exon3每个多态位点的基因型进行分析，发现各位点基因型在两组样本中的分布无显著差异。
　　5.通过对哈萨克羊MHC-DQB2 exon2符合条件的18 SNPs个位点进行连锁不平衡分析，得到exon2存在13个连锁域，分别命名为Block1-Block13，其中有9个Block（Block2、Block3、Block4、Block6、Block7、 Block8、Block10、Block12、Block13）个属于强连锁不平衡。对MHC-DQB2exon3进行连锁不平衡分析，得到exon3存在8个连锁域，分别命名为Block1-Block8，其中有4个Block（Block1、Block2、Block5、Block8）个属于强连锁不平衡。
　　6.经SHEsis软件单倍型分析发现，由哈萨克羊MHC-DQB2 exon233个SNP位点构建得到了17种单倍型，其中Hap12、Hap13、Hap14、Hap15、Hap16、Hap17阳性组频率远高于阴性组频率，达到了显著性差异水平。由exon3的18个SNP位点构建得到21种单倍型，Hap4、Hap6的阳性组频率远低于阴性组频率达到了显著性差异水平。
　　结论：
　　1.哈萨克羊MHC-DQB2基因exon2、exon3均存在丰富的SNPs位点和SAPs位点，且exon2的SNPs位点和SAPs位点以及氨基酸错义突变位点都较之exon3更为丰富。
　　2.初步推测哈萨克羊MHC-DQB2基因exon29C/G位点与布鲁氏菌易感性相关，9G/C、117G/T、131C/G、157C/A、180G/A5个位点某种基因型与布病的易感性相关。初步分析认为MHC-DQB2 exon3的155T/C与绵羊布鲁氏菌病易感性相关。
　　3.哈萨克羊MHC-DQB2基因exon2的9个强连锁不平衡Block以及exon3的4个强连锁不平衡Block内的基因位点可能是连锁遗传的。
　　4.初步推测，对哈萨克羊MHC-DQB2 exon2而言，具有Hap12、Hap13、Hap14、Hap15、Hap16、Hap17这6种单倍型组合的个体对布病更易感；对哈萨克羊MHC-DQB2 exon3而言，具有Hap4、Hap6的个体对布病有更高的抗性，具有Hap9的个体对布病更易感。

目录

声明

部分缩写的中英文对照

引言

第一章 文献综述

1.1 布鲁氏菌病

1.1.1 布鲁氏菌的发现

1.1.2 布鲁氏菌的种类及特征

1.1.3 布鲁氏菌病的感染及发病机制

1.1.4 布鲁氏菌病的发展形势

1.1.5 布鲁氏菌病的诊断检测及防控措施

1.2 主要组织相容性复合体（MHC）

1.2.1 MHC概述

1.2.2 MHC分子结构与功能

1.2.3 绵羊MHC（OLA）概述

1.2.4 MHC（OLA）-DQB2基因多态性

1.2.5 MHC（OLA）与疾病的相关研究

1.3 单核苷酸多态性（SNP）

1.3.1 SNP概述

1.3.2 SNP的检测方法

1.3.3 SNP与疾病的相关研究

1.4 单倍型研究现状

1.4.1 单倍型概述

1.4.2 单倍型分析及其在疾病相关性研究中的作用

1.5 本研究的目的及意义

第二章 绵羊MHC-DQB2 SNPs检测及其与布鲁氏菌病易感性相关性

2.1 实验材料

2.1.1 血液样品

2.1.2 主要药品及试剂

2.1.3 引物

2.1.4 培养基及试剂的配制

2.1.5 主要分子生物学软件

2.2 实验方法

2.2.1 血样的采集

2.2.2 虎红平板凝集试验

2.2.3 血液基因组DNA的提取及检测

2.2.4 引物设计和PCR反应体系

2.2.5 SSCP电泳及银染显色

2.2.6 目的片段的回收纯化

2.2.7 克隆测序

2.3 结果与讨论

2.3.1 布鲁氏菌血清检测结果

2.3.2 基因组DNA的提取及电泳检测

2.3.3 MHC-DQB2 exon2、exon3的PCR扩增结果检测

2.3.4 SSCP分析

2.3.5 绵羊MHC-DQB2 基因SNP与SAP分析

2.3.6 绵羊MHC-DQB2 基因SNP与布鲁氏菌病的相关性

2.4 结论

第三章绵羊MHC-DQB2单倍型构建及与布鲁氏菌病易感性关联分析

3.1 实验材料

3.1.1 实验材料

3.1.2 主要药品及试剂

3.1.3 主要分子生物学软件

3.1.4 实验方法

3.2 结果与讨论

3.2.1 Hardy-Weinberg最小等位基因频率检验及平衡的吻合度检验

3.2.2 哈萨克羊MHC-DQB2的连锁不平衡分析

3.2.3 绵羊MHC-DQB2单倍型与布鲁氏菌病易感性相关性

3.3 结论

第四章 总结与展望

参考文献

致谢

作者简介

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