干扰猪Zfx基因性控效果及对母猪繁殖性能影响

摘要

生物的雌雄二态性的存在为后代的繁殖和发展提供了重要条件。哺乳动物雌雄二态性的最直接特征就是雌雄比例的平衡和差异。而Zfx（Zinc finger-X，Zfx）基因及其家族则是影响哺乳动物雌雄比例平衡的重要因子。Zfx是一种位于X染色体上的能够编码锌指状蛋白的特异基因，存在于雄性哺乳动物睾丸组织的曲精细管中单倍体X生精细胞的细胞核内，具有转录激活的功能，可能直接或间接参与X精子的发育和生成。本研究参照猪的Zfx基因的序列特征，按照RNA干扰片段的设计原则，合成不经过病毒包装的PLL3.7质粒载体，实验室模拟猪睾丸生精细胞环境创建生精细胞和支持细胞共培养体系，经过体外离体培养转染，在mRNA水平检测干扰载体效果，然后优选干扰载体，优化实体干扰效果，采用散点睾丸注射的方式，分不同剂量和针次梯度对公猪睾丸进行注射干扰试验。经随机分群和人工授精，追踪记录其后代性别及其繁殖性能。从而探讨干扰猪Zfx基因性控效果及对母猪繁殖性能的影响。具体研究结果如下：
　　1、猪Zfx基因RNAi重组载体的构建依据NCBI的Gene bank中的猪Zfx基因的Nucleotide核苷酸序列，参照siRNA设计步骤，设计1条符合条件的siRNA,再选择PLL3.7合适的酶切位点，合成相对应的shRNA，经过合链和酶切连接，测序及PCR鉴定，成功构建干扰载体PLL3.7/N。
　　2、干扰载体细胞水平的验证采集30日龄左右的仔猪睾丸，通过反转录和相对实时定量验证在细胞水平下，干扰载体PLL3.7/N引起生精细胞mRNA表达显著下降。其Zfx基因的mRNA表达量为44％，与对照组相比差异显著（P<0.05）。
　　3、猪体内干扰试验通过无内毒素大提质粒试剂盒，纯化富集出高纯度和浓度的原核表达克隆的PLL3.7/N干扰载体。选取健康种公猪18头，随机分为6组，每组各3头，用高压灭菌的PBS，按照终体积7mL，0.5mg/管、1.0mg/管、1.5mg/管的剂量，对照组为PLL3.7空载体,剂量为1.5mg/管，临近注射前每管添加1mL双抗混匀。两侧睾丸，每间隔10天注射一针，共连续注射3针后（另外6头公猪分别为1.5mg/侧共注射一针组、1.5mg/侧共注射两针组），休养4天并排精后安排相同饲养条件下分栏饲喂，采集精液，检测鉴定精液品质，并进行人工授精，配种时间为60天（一针组配30天、两针组配20天)，保证每个试验组每天都有1头公猪与2头以上的母猪配种。人工授精配种后，统计产仔性别比例。结果表明：总体数据显示，第3次注射质粒后，0.5mg/侧三针组雄性仔猪比例为54.1%，与对照组性别比例相比差异不显著（P＞0.05）。1.0mg/侧三针组雄性仔猪比例为63.2%，与对照组相比差异极显著（P＜0.01）。1.5mg/侧三针组雄性仔猪比例为68.82%，与对照组相比差异极显著（P＜0.01）。1.5mg/侧共注射两针组雄性仔猪比例为61.72%，与对照组相比差异极显著（P＜0.01）。1.5mg/侧共注射一针组雄性仔猪比例为48.22%，与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。
　　分时间间隔显示，第3次注射质粒后，在第1、2、3个月，0.5mg/侧三针组产雄性仔猪的比例分别是56.08%、53.14%、50.79%，与对照组相比均差异不显著（P＞0.05）；1.0mg/侧三针组产雄性仔猪的比例分别是66.67%、63.9%、53.13%，与对照组相比分别是差异显著（P＜0.05）、差异显著（P＜0.05）、差异不显著（P＞0.05）；1.5mg/侧三针组产雄性仔猪的比例分别是72.28%、70.05%、53.33%，与对照组相比分别是差异极显著（P＜0.01）、差异极显著（P＜0.01）、差异不显著（P＞0.05）。试验说明通过RNA干扰技术和睾丸局部注射，体内定向干扰抑制公猪睾丸中X精子正常发育，提高Y精子的竞争优势，从而控制猪后代性别的技术切实可行。PLL3.7/N质粒对Zfx基因的干扰作用与注射次数、注射剂量和持续时间有关，1.5mg/侧的剂量是本试验性控效果最佳的注射剂量。注射时间方面，从第二针开始，性控效果明显，1.5mg/侧注射组的雄性仔猪比例达到61.72%，差异极显著（P＜0.01），到第三针达到68.82%，差异极显著（P＜0.01）；性控效果有效时间是从第二针开始的。
　　4、注射重组载体对与配母猪繁殖性能影响的追踪检测通过公猪注射后（0.5mg/侧三针组、1.0mg/侧三针组、1.5mg/侧三针组、1.5mg/侧共注射两针组、1.5mg/侧共注射一针组）与母猪配种，分栏管理饲养，并跟踪记录统计相应组别人工授精的母猪繁殖性能数据，包括受胎率、分娩率、窝产仔率、活仔率、健仔率、畸形死胎木乃伊率、初生重、断乳存活率。结果显示：5种注射条件，对与配母猪繁殖性能的影响均不显著。
　　结论：通过睾丸注射法，干扰Zfx基因进行的猪性别控制，对母猪的繁殖性能没有影响。

目录

声明

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前言

第一章 文献综述

1动物性别控制

1.1动物性别的起源和性别决定

1.2动物性别控制的方法

2 Zfx基因家族与动物性别控制的渊源

2.1 Zfx基因家族简介

2.2 Zfx基因家族的问世

2.3 Zfx基因及其家族在性别鉴定和控制中的应用

3 动物性别控制相关的其他基因

3.1 SRY/Sry基因

3.2 Dmrt基因家族

3.3 Foxl2基因

3.4 Sox9基因家族

3.5 Gadd45基因家族

3.6 Sly/Slx基因家族

3.7 Gata基因家族

3.8 DAX1基因

4 基因修饰编辑技术

4.1 ZFN技术

4.2 TALEN技术

4.3 CRISPR技术

4.4 SGN技术

4.5 NgAgo RNA切割技术

5 RNA干扰技术及应用

5.1 RNAi的原理

5.2 RNAi的构建和应用

5.3 RNAi的介导途径的选择

5.4 RNAi在动物繁殖中的应用

6 问题与展望

第二章 试验研究

试验一 猪Zfx基因RNAi重组载体的构建

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与小结

试验二 RNAi试验干扰载体细胞水平的验证

1材料与方法

2 试验方法

3 结果与分析

4 讨论与小结

试验三 重组载体的猪体内干扰试验

1材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与小结

试验四 注射重组载体对与配母猪繁殖性能影响的追踪检测

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与小结

结论

参考文献

致谢

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