猪Zfx基因干扰载体筛选及性控效果的验证

摘要

雄性哺乳动物的睾丸是生成精子和分泌雄性激素的场所。Zfx（Zinc finger-X，Zfx）是锌脂蛋白家族成员，位于 X染色体短壁上的性别决定区（TDF）内。Zfx可以作为一个较强的转录激活因子，从而引导靶基因通过核膜定位在 X精子的细胞核内，可能对某些基因在 X精子发生过程中具有转录激活作用，与 X精子的形成发生有关。本研究根据 Zfx基因 mRNA序列特点，设计 shRNA片段，构建重组慢病毒骨架载体，然后进行体外细胞水平 RNAi试验，qPCR分析后，筛选出对 Zfx基因 mRNA表达水平抑制率较高的重组载体，最后通过睾丸注射法注射给公猪，自然交配后，统计后代的性别比例，从而研究干扰 Zfx基因后对猪性别控制的影响。具体研究结果如下：
　　1、猪 Zfx基因的克隆根据鼠和牛 Zfx基因分段设计4对具有重叠区域的引物，采用普通 PCR的方法克隆猪 Zfx基因，之后用 DNAMAN进行拼接，得到的猪 Zfx基因序列长度为2154bp，提交到 NCBI上的登录号为 KF803247。
　　2、重组慢病毒质粒干扰载体的构建根据克隆得到的猪 Zfx基因 mRNA序列，然后根据 RNA干扰设计原则，设计并合成4对 shRNA干扰片段。再以慢病毒骨架质粒pLentiLox3.7（pLL3.7）作为载体，构建了4个靶向 Zfx基因的 shRNA表达载体(pLL3.7/d、pLL3.7/e、pLL3.7/f、pLL3.7/g)。经过测序验证所构建的4个重组表达载体中干扰片段的序列及插入位置均正确，并且调控元件完整。说明这4个 shRNA重组表达载体构建成功，可以用于猪 Zfx基因的体外干扰试验。
　　3、将构建好的重组表达载体进行猪体外 RNAi试验养殖场采回27-32日龄的仔猪睾丸，应用两步酶消化法分离出生精细胞，进行体外共培养。通过高效转染试剂盒（HET）将构建好的4个 shRNA重组表达载体分别转染生精细胞。待36-48小时后提取细胞总RNA，利用 qPCR检测 mRNA的表达水平。初步在细胞水平上筛选出3个干扰效果较好的 shRNA重组表达载体 pLL3.7/d、pLL3.7/e、pLL3.7/f，Zfx基因的 mRNA表达量分别为55％、56%、44%，与对照组相比均差异显著（P<0.05）。
　　4、将筛选的重组表达载体进行猪体内 RNAi试验选取健康公猪6头，随机分为3组，每组各2头，将用含双抗的 PBS稀释的质粒 pLL3.7/d、pLL3.7/e、pLL3.7/f分别注射到3组公猪睾丸内，每头3mg（1.5mg/侧），每隔9天注射一次，共注射3次，质粒pLL3.7/d在三次注射完后进行配种，而质粒 pLL3.7/e和 pLL3.7/f每次注射完后配种。结果显示：注射质粒 pLL3.7/d组的雄性仔猪比例为69.9%，与正常的1:1性别比例相比均差异显著；分别注射质粒 pLL3.7/e和 pLL3.7/f的试验组，三个时间点每次配种所得的后代仔猪性别比例均差异不显著，但三个配种时间所产后代总计，pLL3.7/e的仔猪性别差异显著(P＜0.05)，总雄性仔猪比例为59%；pLL3.7/f差异不显著(P＞0.05)，雄性仔猪比例分别为49%。实验说明对 Zfx基因进行干扰可以影响 X精子的受精能力。

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前言

综述部分

1 动物性别控制相关基因

2、 RNA 干扰技术及应用

3 RNAi 的应用

4 问题与展望

试验研究

试验一 猪 Zfx 基因的克隆

试验二 猪 Zfx 基因 shRNA 表达载体的构建

试验三 重组表达载体进行猪体外 RNAi 试验

试验四 重组表达载体进行猪体内 RNAi 试验

参考文献

结 论

致谢

作者简介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表