细粒棘球绦虫六钩蚴M26基因的克隆、表达及阳性杂交瘤细胞的筛选

摘要

细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)主要寄生于犬、狼、狐狸等犬科动物终末宿主体内，其虫卵和孕节随粪便排出体外，污染草料和饮水，牛、羊以及人等中间宿主吞食虫卵后感染此病，进入消化道的六钩蚴钻入肠壁经血流或淋巴散布到体内各处，主要在肝和肺脏引起病变导致生长缓慢，严重危害人的健康和畜牧业的快速发展，给世界经济造成严重损失。因此，防治此病在人类健康和畜牧业发展方面非常重要。长期以来，各国研究者都在探索快速诊断此病的方法，但是并未在早期诊断方面取得突破性成果。绵羊是该寄生虫的中间宿主，若在绵羊感染早期，即在六钩蚴进入血液，早期分泌蛋白时诊断出此病，并采取有效治疗措施，将对控制此病流行具有重要意义。目前，包虫病的诊断方式主要通过影像检测（X线射片，CT，超声，MR，DSA/SCA），皮内试验及血象检测等。但这些方法多为后期诊断（即形成包囊后）。而本试验的方法是采用六钩蚴分泌蛋白为抗原通过 ELISA法对包虫病进行早期诊断，目前针对包虫病早期诊断的相关研究国内外尚未有过报道。因此选择特异性高的抗原，建立敏感性高以及特异性强的早期诊断方法十分必要。本研究为了探索在感染早期能够检测出此病的抗原，在实验室前期研究基础上选择了六钩蚴差异表达蛋白——副肌球蛋白（M26）作为研究对象，经原核表达制备多克隆抗体和筛选阳性杂交瘤细胞，建立ELISA方法检测感染早期宿主血清中的抗原，即六钩蚴分泌的蛋白。为寻找有效的诊断抗原和建立高效、特异的诊断方法进行了如下试验。
　　1.细粒棘球六钩蚴抗原基因的筛选及原核表达：在本实验室以细粒棘球绦虫的成虫，六钩蚴，原头蚴为材料，通过 iTRAQ方法分离检测差异蛋白，其中六钩蚴的差异表达蛋白可作为早期诊断抗原的前期研究基础上，本研究在这些差异表达蛋白中筛选出具有高效免疫保护性的副肌球蛋白（M26），扩增其基因并成功构建克隆载体和表达载体，经原核表达得到大小约为41kDa的重组蛋白，蛋白浓度为0.5 mg/mL，纯度达85％。
　　2.M26多克隆抗体的制备与纯化：以 M26为抗原免疫新西兰大白兔，成功制备了M26多克隆抗体，抗体效价为1:12800。经过 Western blot验证，有且只有一条带，表明该抗体能够特异性识别M26。采用间接ELISA法利用多克隆抗体检测人工感染绵羊包虫病早期各时间点（5-10h，24 h和48 h）血清中副肌球蛋白，结果表明，当多抗的稀释倍数在1:3200-1:12800时，各时间点的样品孔与阴性孔的数据比值均大于或等于2.1，即为阳性，说明各时间点都有该蛋白。
　　3.M26阳性杂交瘤细胞筛选：以 M26作为抗原免疫 Balb/c小鼠，经细胞融合、杂交瘤筛选和 E L I S A法，筛选出2株阳性杂交瘤细胞，通过间接ELISA法利用此细胞株检测人工感染绵羊细粒棘球绦虫早期各时间点（5-10 h，24 h和48 h）血清中副肌球蛋白，在10 h和24 h检测出该蛋白，结果说明此检测方法成功建立，可以表明利用该蛋白作为抗原采用间接ELISA法能够有效诊断出绵羊感染早期包虫病。

目录

声明

前言

第一篇 文献综述

第一章 棘球蚴病的研究进展

1 病原学形态

2 生活史

3种类及基因型

4 流行病学

5 致病作用

6 诊断CE

7 治疗

8 防治

第二章 副肌球蛋白在寄生虫病诊断方面的研究进展

1 副肌球蛋白的分布与特征

2 副肌球蛋白的分子生物学特征

3 副肌球蛋白疫苗研究

4 本试验的目的意义

第二篇 试验内容

第一章 细粒棘球绦虫六钩蚴M26基因的克隆及原核表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二章 M26多克隆抗体的制备

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第三章 M26阳性杂交瘤细胞的筛选

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

全文结论

创新点

参考文献

致谢

作者简介

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