甲胎蛋白调控肝癌细胞(HepG2)增殖的作用机制研究

摘要

目的： 甲胎蛋白（AFP）是哺乳动物胎儿的一种主要胞浆蛋白。成人血清中高浓度的AFP与原发性肝癌和畸胎瘤有关。因而过去一直被认为是诊断原发性肝癌的特异性肿瘤标志物，具有早期诊断、鉴别诊断及确立诊断的作用。AFP在肿瘤的发生发展中的诊断价值是勿庸置疑的。然而，它不仅仅是单纯作为一种伴随出现的肿瘤特异性蛋白而存在。近年来，许多科学家经过反复研究发现甲胎蛋白在肿瘤发生、发展过程中不是一种伴随现象，而是一种与肿瘤细胞生长密切相关的内源性蛋白。虽然人们已发现血清中AFP水平的变化与非正常的生长表型相关，但它通常被认为是一种协同效应，而不是导致表型改变的因素。至今为止，我们仍不能肯定AFP是否为出生缺陷与肿瘤发生中导致生长表型改变的直接因素。AFP在肝癌发生过程中的作用或者效应尚不清楚。此研究的目的即分析AFP的相关功能，检测其调控肝癌细胞增殖的能力，并探讨其涉及的可能机制。 方法： 在本研究中，我们利用生物信息技术设计了一种以AFP为靶位的shRNA。在化学合成shRNA的cDNA双链后构建入质粒重组表达载体与重组腺病毒载体中，利用其进行体内转录表达特异性AFPsiRNA。鉴于需要研究长期AFP基因的抑制效果，我们通过质粒重组表达载体系统建立了稳定转化AFPsiRNA的细胞系。我们应用这些载体抑制AFP在HepG2细胞中的表达，通过Western blot与半定量RT-PCR分析确定了AFPsiRNA的高效性与特异性。为确定AFP静默对于HepG2细胞生长的影响，我们应用软琼脂克隆形成实验与生长曲线分析方法进行细胞表型研究。同时，我们应用表达AFPsiRNA的重组腺病毒Adv-AFPsiRNA进行HepG2移植裸鼠体内肿瘤生长抑制实验。而后，为探讨导致HepG2细胞生长抑制的相关机制，我们应用TUNEL检测细胞凋亡并通过流式细胞仪分析细胞周期的改变。最后，我们为确定哪些相关基因受到AFP静默影响参与这种细胞周期停滞效应，利用cDNA芯片技术分析了AFP表达降低的HepG2细胞基因表达谱的变化并进行了半定量RT-PCR验证。 结果： 1．Western blot结果表明在pCDNA3．1/AFP+pENTR/U6/AFPsiRNA瞬时转染HEK293细胞48小时后，与空白对照（pCDNA3．1/AFP+pCDNA3．1）和阴性对照（pCDNA3．1/AFP+pENTR/U6/LacZsiRNA）相比，AFP的表达水平有了显著的下降，蛋白表达抑制率达到90%。用重组Adv-AFPsiRNA感染HepG2细胞48小时后，通过western blot检测，AFP的表达水平呈明显而特异性的降低，蛋白表达的抑制率达75%。而与之相对应的，Adv-LacZsiRNA对于AFP的表达水平则没有明显的影响。利用半定量RT-PCR方法验证AFPsiRNA对于AFP在mRNA水平上的干扰作用。结果显示，在内参β-actin表达量相对一致的情况下，与阴性对照HepG2（-）相比，HepG2-B5细胞内AFPmRNA水平明显降低，抑制率达92%。 2．通过克隆形成实验，我们证实感染AFPsiRNA重组腺病毒的HepG2细胞克隆形成数与对照组比较降低了85%。在生长曲线分析中，pSilencer2．1-U6neo/AFPsiRNA稳定转染的HepG2细胞（HepG2-B5）与对照组相比，生长速度呈明显下降趋势。在HepG2移植裸鼠体内肿瘤生长抑制实验中，Adv-AFPsiRNA注射组的肿瘤生长与对照组相比受到明显的抑制（p<0．001）。 3．TUNEL原位凋亡检测结果显示在Adv-AFPsiRNA感染细胞中未呈现明显的细胞凋亡，Adv-LacZsiRNA感染细胞和未处理细胞也没有明显细胞凋亡。与之相比，用已知可引起细胞凋亡的抗肿瘤药物一鬼臼毒素（VM-26）（0．09mg/ml）处理48小时的HepG2细胞则多数呈现明显的凋亡。而HepG2细胞（HepG2-B5）与对照组相比，生长速度呈明显下降趋势。在HepG2移植裸鼠体内肿瘤生长抑制实验中获得的肿瘤经切片制备并HE染色，镜下观察未发现明显的组织学差异。用流式细胞仪进行细胞周期分析的结果显示在加入血清24小时后，处于G0/G1期的HepG2-B5和HepG2（-）细胞比例分别是7%（p=0．385）和64070（p=0．004）。这提示HepG2-B5细胞进入细胞增殖周期的比例下降。 4．应用cDNA芯片技术并经过半定量RT-PCR的验证，我们筛选出一些基因表达水平发生显著变化的细胞周期和细胞增殖相关基因，如cyclin D1、EBAG9、CDC34、SKP2、CSK等。 结论： 实验结果表明AFP在HepG2细胞内蛋白水平与mRNA水平的表达可以被AFPsiRNA显著并特异性地静默。AFP是与HepG2细胞的生长密切相关的，且呈一种正性相关。AFP静默导致的生长抑制作用并不主要由于发生了细胞凋亡，而是细胞周期发生G1/S期转变停滞的结果。这种效应对于肝癌的治疗提供了一种新的基因治疗方式。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

声明

前言

第一部分 靶定AFPsiRNA表达载体的构建及其干扰作用

材料与方法

实验结果

第二部分 AFP表达的降低对于HepG2细胞体内外生长的影响及其作用机制的研究

材料与方法

实验结果

第三部分 导致HepG2细胞周期变化的相关基因研究

材料与方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

致谢