高糖环境对兔骨髓内皮祖细胞和循环晚期内皮祖细胞功能影响的对比研究

摘要

高糖环境对兔骨髓内皮祖细胞和循环晚期内皮祖细胞功能影响的对比研究背景：糖尿病血管病变严重，发病年龄轻，进展快，累及范围广，并且伴有严重的侧支动脉发育受损，是造成糖尿病死亡的主要原因。内皮祖细胞(EPC)是骨髓干细胞的一种亚群，是血管内皮细胞的前体细胞，不仅在血管新生中作用显著，也有强烈的内皮保护作用。成年人体内存在骨髓内皮祖细胞(BM-EPC)和循环内皮祖细胞(circulating EPC)，后者又具有两种亚型，循环早期内皮祖细胞(earlvEPC)和循环晚期内皮祖细胞(late EPC)。研究发现，无论是1型还是2型糖尿病，其内皮祖细胞的增殖、黏附、整合入血管结构以及成血管能力均显著下降，糖尿病血管病变与其内皮祖细胞功能不全密切相关。然而糖尿病影响内皮祖细胞功能的机制、糖尿病对不同来源内皮祖细胞功能影响是否存在差别、内皮祖细胞移植是否会改善高糖环境下缺血心肌的灌注等远未明确。 目的： 1．探讨BM-EPC和late EPC的生物学特征差异。 2．探讨高糖、高胰岛素对体外培养的BM-EPC和late EPC增殖以及血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA表达的影响。 3．探讨四氧嘧啶诱导的糖尿病对兔BM-EPC和late EPC集落形成能力以及增殖和黏附功能的影响。 4．探讨糖尿病来源的BM-EPC和late EPC心肌内移植对四氧嘧啶诱导的糖尿病兔急性心肌梗死的修复作用。 方法： 1．分别抽取健康兔骨髓4ml和外周血10ml，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，在含有VEGF、bFGF、IGF、EGF 的 DMEM/DF12 或 M199 培养液中培养 BM-EPC 和 late EPC；流式细胞仪检测两种细胞的细胞表面标志 CD14、CD34、CD45、CD54、CD105、CD106、CD133、KDR和vWF的阳性率；激光共聚焦显微镜检测两种细胞吞噬ac-LDL以及结合UEA-1的能力。 2．收集健康兔来源的P2代BM-EPC和 late EPC，分为5组：对照组(5.5mmol/l葡萄糖)，glucosell组(1lmmol/l葡萄糖)，glucose30组(30mmol/l葡萄糖)，ins100组(100nmol/l胰岛素)，ins1000组(1000nmol/l胰岛素)，采用不同浓度的葡萄糖和胰岛素刺激。MTT法检测刺激48小时和96小时后两种细胞的增殖能力。RT-PCR法检测两种细胞在接受高糖、高胰岛素刺激96小时后VEGF和bFGF mRNA表达的水平。 3．四氧嘧啶诱导兔糖尿病模型后4周，培养糖尿病组(n=6)和对照组(n=6)动物BM-EPC和late EPC。分别检测原代培养的两组BM-EPC和late EPC集落形成数，以MTT法检测细胞增殖，并检测细胞对纤维连接蛋白的黏附能力。 4．四氧嘧啶诱导糖尿病模型后将动物分为对照组(n=8)，骨髓内皮祖细胞移植组(n=8)和循环晚期内皮祖细胞移植组(n=8)。糖尿病造模6周后结扎动物前降支造成急性心肌梗死模型，之后于对照组心肌内注射M199培养液200μl，骨髓内皮祖细胞移植组注射BM-EPC 5×10<'6>，循环晚期内皮祖细胞移植组注射lateEPC 5×10<'6>。以激光共聚焦显微镜观察移植细胞的分布；以Masson三色染色法检测细胞移植后心肌纤维化面积；以Ⅷ因子免疫组化法标记毛细血管，计算毛细血管密度；以心脏超声观察心功能的改变；以实时定量PCR检测VEGF和bFGF的表达。 结果： 1．BM-EPC 与 late EPC CD14，CD54，CD105，KDR，vWF 阳性率无差异(P>0.05)；BM-EPC CD45，CD133 阳性率高于late EPC(P<0.05)；BM-EPC 的 CD34和 CD106 阳性率低于 late EPC(P<0.05)；两种细胞都能吞噬 ac-LDL 并结合UEA-1，吞噬 ac-LDL 的能力相当(P>0.05)。 2．高糖刺激48小时对BM-EPC增殖功能无明显影响(P>0.05)，刺激96小时后11mmol/l的葡萄糖促进BM-EPC的增殖(P<0.05)，而30mmol/1 葡萄糖与对照组无明显差别(P>0.05)。高糖刺激48小时后，随着葡萄糖浓度的增加，late EPC 增殖能力逐渐减弱(1P<0.05)；刺激96小时后葡萄糖仍呈浓度依赖性抑制 late EPC增殖，glucosell 组增殖能力较对照组明显下降(P<0.05)，glucose30 组不但较对照组(P<0.01)也较glucosell组(P<0.05)明显下降。胰岛素刺激48小时可以促进BM-EPC的增殖，ins100组和ins1000组细胞增殖均较对照组增高(P<0.05)；而随着培养时间的延长胰岛素的促增殖作用则逐渐减弱(P>0.05)。高胰岛素刺激48小时抑制 late EPC 细胞增殖，ins1000 组细胞增殖较对照组(P<0.01)和ins100 组(P<0.05)明显降低；高胰岛素刺激96小时后各组细胞增殖无明显差别(P>0.05)。高糖对 BM-EPC 的 VEGF mRNA 表达无明显影响(P>0.05)，却剂量依赖性地抑制late EPC的VEGF表达，glucosell 组和glucose30组VEGF的表达均较对照组降低(P<0.01)。与对照组比较，1lmmol/l葡萄糖刺激促进 BM-EPC 表达 bFGF(P<0.01)，但30mmol/l葡萄糖刺激则抑制bFGF的表达(P<0.01)。葡萄糖呈剂量依赖性地抑制late EPC表达 bFGF(ins100 组vs 对照组 P<0．05，ins1000组vs对照组P<0．01)。胰岛素对BM-EPC表达VEGF无影响(P>0．05)，1000nmol/1 胰岛素抑制BM-EPC 表达bFGF(P<0．05)。胰岛素抑制late EPC表达VEGF和bFGF，ins100组和ins1000组VEGF和bFGF表达均较对照组降低(P<0．05)，两组之间无差别。 3．四氧嘧啶诱导的糖尿病组和对照组兔BM-EPC的集落形成能力以及细胞增殖、黏附能力无差别(P>0．05)。与对照组比较，糖尿病组late EPC集落形成数量减少(P<0．05)，细胞增殖能力下降(P<0．01)，黏附能力也明显下降(P<0．01)。 4．BM-EPC和late EPC心肌内移植后都可以整合到血管中，形成新生血管。与对照组比较，BM-EPC移植和late EPC移植都明显增加毛细血管密度(P<0．01)，BM-EPC 组血管密度高于late EPC组(P<0．01)。与对照组比较，BM-EPC 移植减少心肌纤维化面积(P<0．05)，而late EPC移植则无此作用(P>0．05)。BM-EPC 移植提高射血分数(P<0．05)，而 late EPC 移植则无此作用。BM-EPC 移植促进VEGF和bFGF的表达(P<0．05)，late EPC 移植组与对照组无差别(P>0．05)。 结论： 1．高糖环境对BM-EPC和late EPC功能的影响在体内和体外均存在差异。四氧嘧啶诱导的体内高糖环境对BM-EPC的数量和增殖、黏附无抑制作用，但抑制late EPC的数量、增殖和黏附。体外高糖环境呈浓度依赖性抑制late EPC的增殖，但不抑制BM-EPC的增殖。 2．高糖抑制late EPC表达VEGF和bFGF，高糖对BM-EPC 表达 VEGF 无影响，30mmol/l高糖也抑制BM-EPC表达bFGF。 3．高胰岛素抑制late EPC表达VEGF以及bFGF，抑制BM-EPC表达bFGF。 4．BM-EPC心肌内移植通过促进血管发生和动脉生成、旁分泌VEGF和bFGF的机制改善糖尿病兔急性心肌梗死后的血管再生，提高心功能。Late EPC移植不能改善心功能。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前 言

第一部分兔骨髓内皮祖细胞及循环晚期内皮祖细胞的培养、鉴定和比较

材料与方法

结果

讨论

第二部分不同浓度葡萄糖、胰岛素干预对内皮祖细胞功能的影响

材料与方法

结果

讨论

第三部分四氧嘧啶诱导的兔糖尿病对骨髓内皮祖细胞和循环晚期内皮祖细胞功能的影响

材料与方法

结果

讨论

第四部分内皮祖细胞心肌内移植对四氧嘧啶诱导的糖尿病兔急性心肌梗死的修复作用

材料与方法

结果

(一)糖尿病兔急性心肌梗死模型的建立

(二)内皮祖细胞移植对心功能的影响

(三)移植细胞的功能学观察

(四)细胞移植对心肌纤维化的影响

(五)毛细血管密度

(六)内皮祖细胞移植的旁分泌作用

讨论

结论

综述糖尿病与内皮细胞功能不全

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致 谢