环孢素A对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠胰岛β细胞损伤的保护作用研究

摘要

我们近几年在临床上开展的肾活检、皮肤活检和肌肉活检都证明，糖尿病人体内存在广泛的多器官免疫损伤。多年来，糖尿病的防治都是以高血糖为中心的治疗策略，因此糖尿病的慢性并发症的发病机理和临床处理都处于思想茫然和束手无策的尴尬境地。为弄清糖尿病发病机理，更好地从疾病的源头预防和治疗糖尿病及其并发症，我们开展了糖尿病多器官的病理免疫学的研究并尝试用环孢素A 进行干预。本试验是整个研究的一部分。 第一部分 环孢素A对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠胰岛功能障碍的作用 目的：建立链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠模型；观察小剂量环孢素 A (CyclosporinA，CsA) 联合胰岛素治疗对糖尿病大鼠胰岛功能的保护作用以及CsA治疗的副作用。 方法：雄性SD大鼠40只，随机分为5组，即正常对照(CON)组；糖尿病对照(DM)组，不给予任何干预措施；单纯胰岛素治疗(INS)组，予中效胰岛素 8U/d 皮下注射；单纯环孢素A治疗(CsA)组，予环孢素A 1 mg/(kg．d)皮下注射；联合治疗(CpI)组，同时给予上述剂量的环孢素A和中效胰岛素。干预4周后处死。每周监测体重，定期监测血糖，24 h尿微量白蛋白定量测定，4周时行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素激发试验(停用胰岛素3日)，处死前取血检测肝肾功能和电解质。通过对胰腺组织的特殊染色(HE和AZON)、免疫组织化学胰岛素抗体染色和透射电镜检测观察大鼠胰岛形态学变化。 结果：32只造模大鼠全部成模。干预4周时，INS和CpI组随机血糖明显低于DM组，CpI 组随机血糖低于CsA和INS组。CpI组大鼠胰岛面积和胰岛素蛋白表达均高于DM和CsA组，较INS 组有升高的趋势(P值分别为0.056和0.057)。 OGTT结果。OGTT各点CpI和INS 组大鼠血糖都低于糖尿病组；CpI组大鼠空腹和120 min血糖与INs组无差别，30和60 min血糖低于INS组。 OGTT葡萄糖曲线下面积的结果为，DM组(70.21±14.47)、INS组(50.21±8.79)、CpI组(38.72±3.98)和CON组(22.55±1.25)，组间差别具有统计学意义。胰岛素激发试验，CpI和INS组在高糖刺激下的胰岛素释放高于DM组；CpI组大鼠试验30和 60min血清胰岛素水平高于INS组。β细胞功能指标，CpI组60 min胰岛素分泌指数(InsE<,60>)高于DM和INS组；Cpl组β细胞功能指数(HBCI)高于DM组，与INS组之间无统计学差异；各组糖尿病大鼠之间InsE<,30>无差别。 形态学观察。光镜HE、AZON染色和透射电镜的研究结论一致，即CpI组β细胞结构更接近于正常对照组结构，胰岛病变较INS组改善更加明显。 生化检查。CpI和INS组大鼠血清总胆红素低于DM和CsA组；CpI组24h尿微量白蛋白低于DM和INS组；CpI和INS组尿素氮水平低于DM组，而CpI组血肌酐低于DM和INS组。 结论：①STZ 诱导的糖尿病大鼠模型成立；②小剂量CsA(1mg.kg.d)具有对糖尿病大鼠胰岛B细胞的保护效应，这一作用需要外源性胰岛素的辅助；③CsA对糖尿病大鼠的肾保护作用不仅仅依赖于血糖控制；④以1 mg/(kg.d)的CsA治疗4周未造成糖尿病大鼠的肝。肾功能损害。 第二部分 环孢素A对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠免疫功能的作用 目的：在得到了小剂量CsA具有β细胞保护作用的结论后，本节继续探讨CsA对STZ诱导糖尿病大鼠胰腺局部和相关淋巴结免疫功能的影响。 方法：实验动物和分组同上。取液氮保存的胰腺组织，提取蛋白，SDS-PAGE蛋白电泳以考马斯亮蓝染色鉴定有无降解，以Western Blotting法鉴定胰腺组织中DCs特异性表面标志物——CDlα的蛋白表达水平，结果以β-actin的蛋白表达进行校正。糖尿病组大鼠，依次取出胰腺引流淋巴结(PDIN)、肠系膜淋巴结(SLN)和脾脏的左侧1/2，行淋巴细胞转化试验；每组每个部位设立细胞对照孔和ConA(20 μg/mL) 刺激孔各8复孔，胎牛血清浓度为10％。T淋巴细胞体外培养68h，离心并留上清备测IL-2；以含MTT的细胞培养液继续培养4h，MTT比色法测定T淋巴细胞增殖活性。取PDIN来源的ConA刺激孔T淋巴细胞培养上清测定IL-2浓度，IL-2测定采用双抗体夹心ELISA法。 结果：胰腺CDlα的蛋白表达水平(较之β-actin)为，CON组(0.046±0.009)、DM组(1.895±0.268)、INS组 (1.565±0.261)、CsA组(0.583±0.125)和CpI组(0.292±0.098)，总体及任意两组间差别均具有统计学意义。 针对糖尿病大鼠进行淋巴细胞转化试验，台盼兰拒染实验活细胞数>98％；PDLN和SLN来源的DM组以及PDLN来源的INS组淋巴细胞刺激指数(SI)显著升高；PDLN和SLN来源的CsA和CpI组以及脾脏淋巴细胞SI均无明显升高。 来源于PDLN的淋巴细胞在丝裂原刺激下IL-2分泌量的比较结果显示，3个干预组IL-2均低于DM组，CsA和ICpI组低于INS组，CsA和lCpI组之间无差别。各组之间差别具有统计学意义，F=48.197，P=0.000。 结论：①CsA和胰岛素联合治疗在阻断胰岛局部DCs浸润上效果最明显，这可能是免疫抑制剂与胰岛素双重作用的结果；②PDLN是糖尿病大鼠自身免疫反应启动/扩增的部位，CsA 可明显抑制PDLN中T淋巴细胞的增殖活性，胰岛素则无此作用；③CsA可抑制体外培养的PDLN来源的T淋巴细胞在丝裂原刺激下IL-2的分泌，胰岛素作用较弱。 第三部分 环孢素A对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡和前炎性细胞因子表达的作用 目的：前面已明确，小剂量CsA对STZ诱导糖尿病大鼠的胰岛β细胞功能具有保护效应，并且对胰岛局部和引流淋巴结的免疫反应都具有抑制作用。本节探讨小剂量CsA对STZ 诱导糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的影响和炎性因子在其中发挥的作用。 方法：实验动物和分组同上。TUNEL法检测胰岛细胞凋亡，并通过对连续切片胰岛素蛋白表达的免疫组化检测，鉴定凋亡的细胞为β细胞，计算β细胞凋亡率。通过以相应细胞因子抗体对胰腺石蜡切片的免疫组织化学染色，测定前炎性细胞因子TNFα、IL-1β和 MCP-1 在胰岛的蛋白表达，同时测定胰岛面积，计算单位胰岛面积上细胞因子的蛋白表达量。提取胰腺总RNA，进行完整性鉴定； T-A 克隆构建含有目的片段的重组质粒，制备标准模板；序列测定无误后，实时荧光定量PCR法检测胰腺中TNFα、MCP-1和凋亡蛋白Caspase-3 的 mRNA 水平，结果以B-actin进行校正。 结果：TNFα的蛋白表达在DM和INS组高于正常对照组，CsA和CpI组低于DM和INS组，CsA和CpI组之间或DM和INS组之间TNFα水平无差别。TNFα的mRNA水平与其蛋白表达水平的趋势一致，但CsA组与其它各组之间差别无统计学差异。 MCP-1 的蛋白水平和mRNA水平完全一致。糖尿病大鼠MCP-1的蛋白和基因表达均高于正常对照组；CsA和Cpl组低 于DM和INS组；CsA和CpI组之间或DM和INS组之间MCP-1的蛋白和mRNA水平无差别。 IL-1β的蛋白表达结果为，DM、INS和CsA 组高于正常对照组，各干预组IL-1β蛋白表达均低于DM组；INS组和CpI组IL-1β的水平低于CsA组，前两者之间差别无统计学意义。 糖尿病大鼠β细胞凋亡率高于正常对照组；INS、CsA和CpI组较之DM组凋亡率降低；CpI组β细胞凋亡率低于INS和CsA组，后二者之间差别无统计学意义。凋亡蛋白Caspase-3的mRNA 水平与β细胞凋亡率基本一致，仅CsA组与DM组之间无差别。 针对胰岛β细胞凋亡率的多元相关和回归分析显示，与β细胞凋亡率呈正相关的是 Caspase-3 基因表达量、MCP-1 基因表达量、IL-1β蛋白表达量和4周随机血糖；呈负相关的是大鼠4周体重。在回归分析中，先后进入方程的是Caspase-3基因表达量(R<'2>=0．620)和IL-1 β蛋白表达量(累积R<'2>=0．680)。 结论：①小剂量CsA(1mg．kg．d)使糖尿病大鼠胰腺凋亡蛋白Caspase-3基因表达量下降、胰岛β细胞凋亡减少，这是CsA保护胰岛功能的有力证据；②无论在mRNA 水平还是蛋白水平上，糖尿病大鼠胰腺中细胞因子 TNFFα、IL-1B和MCP-1表达都呈上调趋势；③CsA与胰岛素联合治疗可抑制前炎性细胞因子在胰腺的高表达；其中，免疫抑制剂对TNFα和MCP-1的影响较大，而IL-1β蛋白表达量下降与胰岛素治疗关系更加密切。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一部分环孢素A对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠胰岛功能障碍的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

第二部分环孢素A对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠免疫功能的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

第三部分环孢素A对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡和前炎性细胞因子表达的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

综述 第一节 自身免疫性糖尿病与胰岛β细胞凋亡

综述 第二节 胰岛β细胞凋亡与细胞毒性T淋巴细胞的激活

综述 第三节 细胞毒性T淋巴细胞诱导β细胞凋亡

综述 第四节 环孢菌素A与自身免疫性糖尿病和胰岛β细胞凋亡

参考文献

致谢