环孢素A、胰岛素对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨转换及其分子机制影响的研究

摘要

环孢素 A、胰岛素对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨转换及其分子机制影响的研究我们近几年在临床上开展的肾活检、皮肤活检和肌肉活检都证明，糖尿病人体内存在广泛的多器官免疫损伤。多年来，糖尿病的防治都是以高血糖为中心的治疗策略，因此糖尿病的慢性并发症的发病机理和临床处理都处于思想茫然和束手无策的尴尬境地。为弄清糖尿病发病机制，更好地从疾病的源头预防和治疗糖尿病及其并发症，作者开展了糖尿病多器官的病理免疫学的研究并尝试用环孢素A进行干预。本实验是整个研究的一部分。 第一部分 环孢素A、胰岛素对链脲佐菌素诱导的糖尿病(DM)大鼠骨转换影响的研究 目的：1型DM(T1DM)是因胰岛素绝对缺乏引起的以高血糖为特征的一组综合征。其慢性并发症包括长时间的慢性骨丢失。既往关于T1DM骨丢失的机制研究表明骨形成减低，而关于骨吸收变化研究结果不一，多数研究提示，骨吸收减低或无变化，但关于晚期糖基化终末产物(AGEs)作用的研究表明，AGEs主要是刺激骨吸收，故DM骨丢失的机制有待进一步研究。CsA(CsA)是一种免疫抑制剂，可用于器官移植后的抗排斥反应和许多免疫性疾病，包括T1DM早期。随着DM 肾病肾移植患者增加，CsA 的使用逐渐增多。因此，我们以链脲佐菌素(STZ)诱导的DM大鼠为模型，观察其骨量和骨转换的变化情况以及胰岛素、CsA 干预的影响，同时CsA对于正常大鼠骨量和骨转换的影响。 方法：62只雄性SD大鼠，随机分为正常对照组(CON)、正常+低剂量CsA干预组(NL)、正常+高剂量CsA干预组(NH)、单纯DM组(DM)，DM+低剂量CsA 治疗组(DML)，DM+高剂量CsA治疗组(DMH)，胰岛素治疗组(INS)。以静脉注射STZ的方法制造DM大鼠模型，各低、高剂量CsA干预组按1mg/kg/d、8mg/kg/d皮下注射 CsA，INS 组按 6U/kg/d 给予中效胰岛素皮下注射，成模8周后处死。留取血尿标本分别检测胰岛素、钙、磷、碱性磷酸酶、骨钙素和24小时尿钙。留取左侧胫骨近端2/3，行骨形态计量学分析。分离右侧股骨和椎骨(L1-5)，行骨密度测量和骨生物力学试验。结果：各组大鼠血钙、磷、碱性磷酸酶水平无显著差异。STZ诱导的DM大鼠24小时尿量和尿钙显著增加，血清骨钙素水平减低，股骨和腰椎骨密度较正常对照组显著减低，骨计量形态学参数显示骨小梁骨量显著减低，动力学参数表明DM大鼠类骨质表面、骨表面激活频率、组织水平的骨形成速率显著减低，力学测试示骨力学性能减低。胰岛素干预可使DM大鼠血糖水平下降，24小时尿量和尿钙水平减低，血清骨钙素水平增加，股骨和腰椎骨密度增加，骨力学性能改善，骨计量形态学参数显示骨小梁骨量增加，但均未达正常对照组水平。动力学参数表明胰岛素干预可使DM大鼠类骨质表面、骨表面激活频率、组织水平的骨形成速率增加，可达到正常对照组水平。低剂量CsA干预正常大鼠. 结果：骨密度，骨计量学指标、骨生物力学指标均与正常对照组无显著差异。高剂量CsA干预正常大鼠，不影响大鼠血糖，骨密度、骨形态学参数、骨力学指标较正常对照组下降，同时血清骨钙素水平、，骨动力学参数中的类骨质表面、标记表面、组织水平的骨形成速率较正常对照组增加。低剂量CsA干预DM大鼠，骨密度，骨计量学指标、骨生物力学指标均与：DM组无显著差异。高剂量干预DM大鼠，亦不影响大鼠血糖，可使DM大鼠骨密度和表示骨小梁骨量的形态学参数和骨力学性能均进一步减低，同时可使DM大鼠降低的血清骨钙素水平增加，骨动力学参数也显示可使DM大鼠降低的骨形成速率增加。 结论：STZ诱导的DM大鼠骨形成速度减低造成骨量减少，骨力学性能下降。胰岛素治疗可通过刺激骨形成，增加DM大鼠骨量，改善骨力学性能。低剂量CsA不影响正常大鼠和DM大鼠骨量、骨力学性能和骨转换状况。高剂量CsA干预正常大鼠可能诱发高转换型骨量丢失和骨力学性能减低。高剂量CsA干预8周可使DM大鼠骨丢失进一步加重，并使DM大鼠低转换型骨丢失向高转换型骨丢失转变。 第二部分 环孢素A、胰岛素对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨转换分子机制影响的研究 目的：T1DM 的一个重要的慢性并发症就是慢性的骨丢失。TlDM 导致骨丢失的作用机制主要是骨形成速度减慢，关于骨吸收的变化情况有待进一步明确。本研究拟通过检测STZ诱导的DM大鼠和胰岛素、CsA干预后的大鼠骨组织中标志破骨活性的核因子-κ B受体激活物配基(RANKL)/护骨素(OPG)mRNA水平和标志成骨细胞分化晚期的骨钙素(OC)mRNA水平，以及调控成骨细胞分化成熟的转录因子核结合因子1(Cbfal)、OSX mRNA 的表达水平，分析DM大鼠骨丢失的分子机制和胰岛素、CsA干预对其的影响。在增龄和废用性骨质疏松时，骨组织中脂肪组织形成增加而成骨细胞生成或成熟减少导致骨丢失。既往有研究显示，STZ诱导的DM小鼠外周组织脂肪含量减少，但骨髓中脂肪增加伴骨量减少。因而本研究拟通过计数大鼠骨髓脂肪细胞数量，同时检测骨组织中标志脂肪细胞的过氧化物酶增殖激活物受体γ2(PPAR γ 2)mKNA 表达水平，证实骨量减少是否与DM状态下这种脂肪转移机制有关，并分析胰岛素和CsA干预分别对其有何影响。 方法：实验动物和分组同上。分离右侧胫骨近端1/3(去除骨骺)，提取骨组织总 RNA，用实时荧光定量 RT-PCR 的方法检测大鼠骨组织中RANKL，OPG，OC，Cbfal，OSX 和 PPAR γ2 mRNA的表达水平，分离左侧股骨近端1/2，制做脱钙骨切片，计数骨髓中脂肪细胞数量。 结果：STZ诱导的DM大鼠骨组织中标志骨吸收的RANKL/OPG mRNA 水平和标志成骨细胞分化成熟晚期的OC以及调控成骨的转录因子 OSX、CbfalmRNA水平显著减低，而标志脂肪细胞的 PPAR<,γ2>mRNA 水平显著增加，骨髓脂肪细胞计数增加伴皮下、肝脏脂肪减少。胰岛素干预可使DM大鼠骨组织中OC、OSX、Cbfal mRNA 水平增加，而不影响骨组织中 RANKL/OPG mRNA 水平，同时可使DM大鼠骨组织中标志脂肪细胞的PPAR<,γ2>mRNA水平下降，骨髓脂肪细胞计数减少。CsA 干预结果显示，低剂量不影响正常大鼠和DM 大鼠骨组织中所研究的各因子mRNA水平和骨髓脂肪细胞计数。高剂量8周可使正常大鼠和DM 大鼠骨组织中RANKL/OPG mRNA 水平和OC、OSX mRNA水平均增加，但骨组织中Cbfal mRNA 水平无显著变化，也不影响正常和DM大鼠骨组织中标志脂肪细胞的PPAR<,γ2> mRNA 水平和骨髓脂肪细胞计数。 结论：所研究的DM大鼠骨组织中骨吸收和骨形成的各标志因子mRNA水平均下降，考虑为低转换型骨量丢失。同时，骨组织中标志脂肪细胞的PPAR<,γ2>mRNA 水平和骨髓脂肪细胞计数增加，而DM大鼠皮下、肝脏脂肪减少，提示这种脂肪转移机制可能也存在于DM大鼠骨丢失过程中。胰岛素干预可使DM大鼠骨组织中标志成骨活性的各因子mRNA水平增加，而对标志骨吸收的RANKL/OPG mRNA 水平无影响，提示胰岛素主要通过刺激骨形成而非抑制骨吸收增加 DM 大鼠骨量。同时胰岛素组骨组织中PPAR<,γ2> mRNA和骨髓脂肪细胞计数减少，提示胰岛素可能抑制骨髓多能间充质干细胞向脂肪细胞分化，促进其向成骨细胞分化，发挥促成骨作用。低剂量CsA不影响正常和DM大鼠骨转换各因子和 PPAR γ2 mRNA和骨髓脂肪细胞计数。高剂量CsA可同时增加骨组织标志骨吸收和骨形成的各因子mRNA水平，但不影响骨组织中PPAR<,γ2> mRNA和骨髓脂肪细胞计数，提示高剂量可能诱发正常和DM大鼠高转换型骨量减少。

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论文说明:缩略语

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第一部分 环孢素A、胰岛素对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨转换影响的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 环孢素A、胰岛素对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠骨转换分子机制影响的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢