类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞表达survivin的研究

摘要

目的：寻求类风湿性关节炎(RA)滑膜细胞分离培养快速有效的方法，为类风湿性关节炎滑膜细胞体外研究提供方便有效的途径；初步探讨survivin对类风湿性关节炎发生发展的作用，对滑膜细胞增殖影响的机制。 方法：用组织块法、单胶原酶消化法、单胰酶消化法和双酶消化法四种方法分离、培养20例RA滑膜细胞，取其培养第七日细胞计数，取第四代细胞鉴定，免疫组化鉴定细胞，测定分离细胞的数量和纯度。8例正常(半月板损伤患者)滑膜细胞依上述方法培养鉴定。将20例RA滑膜细胞及8例正常滑膜细胞分为四组：甲氨喋呤(MTX)处理组、三氧化二申(AS2O3)处理组、空白对照组和正常滑膜细胞对照组；观察处理不同时间点0h、24h、48h细胞状态，并提取总RNA行RT-PCR检测各组survivin及caspase-3 mRNA表达。用SPSS16.0统计软件进行数据处理。 结果： 1.20例RA滑膜标本培养结果显示组织块法较其余三种方法有效率高，依次为组织块法>双酶消化法>单胰酶法>单胶原酶法。以细胞分离所需主要操作时间为准，四种方法耗时统计学差异有显著性(方差分析，<0.05)，单胶原酶法>双酶消化法>组织块法>单胰酶法。随机选取每种方法培养第七日细胞进行计数，levene检验方差不齐，选择Kruskal-Walls检验，Chi-Square统计量为45.63，自由度为3，P<0.05，可认为四种方法所得细胞数有差异；组织块法及双酶消化法所得细胞数统计学差异无显著性(P>0.05)，其余两种方法得到的细胞数统计学差异亦无显著性(P>0.05)，而后两种方法得细胞数较前两种方法为少，统计学差异有显著性(P<0.05)。组织块培养原代细胞排列有极性，成放射状排列。体外培养的RA及半月板损伤后正常人原代滑膜细胞体外培养3代以后：光镜下细胞以长梭形为主，两极胞突细长，末端多与临近细胞连接并交织成网状，核居中，圆形或椭圆形，核仁明显。 2.细胞鉴定结果：随机选取每种培养方法第4代RA滑膜细胞进行免疫组化染色，结果显示vimentin阳性染色主要位于胞质，呈棕黄色；空白阴性对照组胞质未着色。表达vimentin细胞阳性计分>1者比例均>95％，统计学差异无显著性(P>0.05)。 3.细胞状态及RT-PCR结果：在所选0h点、24h点、48h点分别观察细胞生长状态并测四组MTX处理组、AS2O3处理组、空白对照组及外伤后滑膜细胞对照组survivin及caspase-3表达：(1)可见随时间向前推移，MTX处理组细胞形态有变化，但不明显，少数细胞可见变圆或皱缩、漂浮，细胞数目未见明显增多；AS2O3处理组细胞形态变化较明显，细胞多数变圆、皱缩、漂浮，核不清楚，细胞数目减少；空白对照组细胞形态未见明显变化，细胞数目增多较明显；正常滑膜细胞对照组细胞形态未见明显变化，细胞数目未见明显增多。(2)0h点可见前三组survivin及caspase-3表达，正常滑膜细胞组则未见表达。(3)0h点前三组survivin及caspase-3表达强度统计学无明显差异(P>0.05)，随时间向前推移，MTX处理组survivirt表达逐渐减弱，caspase-3表达逐渐增强差异有统计学意义(P<0.05)；AS2O3处理组survivin表达减弱到消失，caspase-3表达先增强后减弱差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组二者表达未见明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；正常滑膜细胞对照组各时间点均未测得survivin及caspase-3表达。 结论： 1.四种方法体外培养可获得生物学特性稳定的RA滑膜成纤维样滑膜细胞系，其中组织块法是细胞水平建立RA体外实验模型成功率更高的方法，单纯胰酶法是细胞水平建立RA体外实验模型快速的方法。 2.在RA患者，survivin在滑膜成纤维样滑膜细胞的表达增高，在正常细胞对照组则未见明显表达。 3.Survivin抑制成纤维样滑膜细胞凋亡促进类风湿性关节炎滑膜细胞大量增生导致关节侵蚀，进一步分析：(1)survivn可能通过caspase途径诱导细胞凋亡；(2)MTX及AS2O3可能通过抑制survivin表达诱导细胞凋亡，控制RA病情发展。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、类风湿性关节炎细胞水平建模四种方法比较

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、Survivin抑制类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 Survivin与类风湿性关节炎相关性的研究进展

致谢