腺病毒介导的靶向性Akt1和COX-2shRNA抑制SGC-7901人胃腺癌细胞生长的体内外研究

摘要

目的:研究腺病毒介导的靶向性蛋白激酶B1(PKB1/Akt1)和环氧合酶-2(COX-2)短发夹RNA(shRNA)表达载体rAd5-Akt1+COX-2(rAd5-A+C)在体内外对人胃腺癌细胞株SGC-7901生长的抑制效果和探讨其可能的机制。
　　 方法:将腺病毒载体rAd5-A+C体外转染人胃癌细胞株SGC-7901后,荧光显微镜下观察腺病毒rAd5-A+C的转染效率,Real-time PCR和Western blot分别检测对照组SGC-7901、空载组rAd5-HK和治疗组tAd5-A+C中Akt1和COX-2 mRNA和蛋白质的表达；同时利用Western blot进一步检测各组肿瘤细胞核增殖相关抗原Ki-67、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮标志物CD31、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)及凋亡的抑制指标Bcl-2的蛋白表达水平；噻唑蓝比色分析法(MTT法)和流式细胞法评价转染后胃癌细胞的增殖活性。裸鼠皮下移植瘤模型进一步观察rAd5-A+C对胃腺癌SGC-7901生长的抑制效果,并应用免疫组化检测肿瘤相关蛋白Akt1、COX-2、Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1及Bcl-2的表达水平；TUNEL法检测肿瘤组织细胞的原位凋亡。
　　 结果:将腺病毒rAd5-A+C体外转染人胃腺癌细胞株SGC-790124h后,荧光显微镜下观察到腺病毒rAd5-A+C有很高的转染效率,可达90％以上。Real-time PCR检测结果显示治疗组rAd5-A+C的Akt1和COX-2 mRNA表达明显下调,其ACt值分别是(12.26±0.05)和(5.41±0.09),比空载组rAd5-HK(10.63±0.02)、(3.75±0.08)和对照组SGC-7901(10.57±0.02)、(3.73±0.08)增高,而空载组和对照组之间ΔCt值无明显变化。同时治疗组的Akt1和COX-2蛋白表达量与空载组和对照组相比分别下调70.5％和63.7％,空载组和对照组相比Akt1和COX-2蛋白表达差异无统计学意义；并且与胃癌生长相关的指标Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1及Bcl-2的蛋白表达水平也明显下调。体外实验MTT法显示与对照组SGC-7901和空载组rAd5-HK相比较,治疗组rAd5-A+C的胃癌细胞在治疗24h后增殖活性明显被抑制；而细胞周期分析显示rAd5-A+C治疗组进入S期的细胞数减少了13.4％和14.7％,而进入G0/G1期的细胞增加了18.3％和17.3％,细胞阻滞在G0/G1期。体内裸鼠皮下荷瘤模型显示rAd5-A+C可抑制肿瘤的生长；免疫组化法检测肿瘤标本的相关蛋白表达情况显示,治疗组rAd5-A+C的Akt1、COX-2、Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1及Bcl-2表达水平均有明显下调,且rAd5-A+C可诱导肿瘤组织细胞的原位凋亡。
　　 结论:
　　 1.介导靶向性Akt1和COX-2 shRNA的腺病毒载体rAd5-A+C转染胃腺癌细胞株SGC-790124h后有很高的转染效率。
　　 2.在体外实验中腺病毒载体rAd5-A+C转染后可明显敲低胃腺癌癌细胞SGC-7901中Aktl和COX-2的表达,并进而下调与胃腺癌细胞生长相关的指标Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1及Bcl-2的表达。腺病毒载体rAd5-A+C通过下调Akt1和COX-2的表达能明显抑制胃腺癌细胞增殖和血管生成,阻滞细胞周期的进程及诱导肿瘤细胞的凋亡。
　　 3.裸鼠皮下移植瘤模型显示:腺病毒载体rAd5-A+C同样能抑制胃腺癌组织中Akt1和COX-2的表达及下调与胃癌细胞生长相关指标Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1和Bcl-2的表达；腺病毒载体rAd5-A+C通过下调Akt1和COX-2的表达也能明显抑制胃腺癌的生长和诱导胃腺癌组织细胞的凋亡,且与体外实验结果一致；
　　 4.腺病毒载体rAd5-A+C通过下调Akt1和COX-2的表达来抑制胃腺癌细胞SGC-7901生长的机制可能与下调Ki-67、VEGF、CD31、CyclinD1及Bcl-2的表达有关。
　　 5.靶向Akt1和COX2的联合基因治疗可能为胃癌和其他恶性肿瘤的基因治疗提供新的策略。