RNAi抑制COX-2活性对人胃腺癌细胞系SGC-7901生长抑制的体内外研究

摘要

目的：研究COX-2在胃腺癌组织中的表达，探讨COX-2与PCNA，PGE2，VEGF，CD31，cyclinD1在胃腺癌发生发展中作用的相互关系。构建COX-2的siRNA，检测其在胃腺癌细胞株SGC-7901中对COX-2基因表达的抑制作用，以及敲低COX-2的表达后，观察PGE2，PCNA，VEGF，CD31，cyclinD1的表达变化，以及细胞周期，增殖活性，凋亡，侵袭活性的变化，并进一步探讨COX-2在胃腺癌细胞系中的作用机制。应用COX-2siRNA导入裸鼠胃腺癌皮下动物模型后，验证在体内COX-2siRNA对SGC-7901胃腺癌的抑制作用。 方法：第一部分构造胃腺癌组织芯片，利用免疫组化检测COX-2，PCNA，PGE2与VEGF的蛋白表达。第二部分在体外应用RNA干涉技术以Oligofectamine介导siRNA靶向COX-2转染人胃腺癌细胞系SGC-7901后，应用realtimePCR检测目的基因的敲低情况，并用Westernblot和免疫荧光技术检测了RNAi敲低COX-2的表达后，COX-2通路相关基因PCNA，PGE2，Bcl-2，CyclinD1与VEGF的表达变化。并用MTT、annexinV标记、流式细胞术及Matrigel3D生长实验等方法分析了转染前后细胞增殖、凋亡、细胞周期分布和侵袭能力的变化。第三部分中则通过建立裸鼠胃腺癌皮下动物模型，瘤内注射Oligofectamine和siRNA的混合物，动态观察肿瘤生长情况，检测RNA干涉技术敲低SGC-7901裸鼠胃腺癌COX-2的表达后PCNA，VEGF，CD31的表达变化；并应用TUNEL法检测细胞凋亡，对体外实验的结果进一步验证。 结果：1.COX-2在胃腺癌组织中过度表达(68.9％)，且随组织的恶性分化程度升高而表达增强(X2=31.855，P<0.001)。COX-2在胃腺癌组织中的表达与癌旁组织及正常组织相比较具有差异性(X2=14.231，P=0.027)。PGE2，PCNA，VEGF(80.0％，84.4％和73.3％)也在胃腺癌组织中呈现过表达的现象，同时，COX-2，PCNA，PGE2与VEGF表达之间存在正相关性。2.realtimePCR结果提示，转染COX-2siRNA后可明显敲低COX-2mRNA的表达。MTT结果显示转染COX-2siRNA后细胞增殖率与转染nonsensesiRNA和对照组相比明显受抑制(P<0.05)，通过Westernblot和免疫荧光检测发现除COX-2的蛋白明显敲低外，COX-2通路相关基因PCNA，PGE2，Bcl-2，CyclinD1与VEGF的表达水平均明显降低。应用AnnexinV检测发现转染COX-2siRNA组细胞凋亡率明显升高，进一步应用流式细胞术检测细胞周期分布发现S期细胞比例降低，细胞阻滞于G0/G1期。侵袭试验结果显示COX-2siRNA可明显抑制SGC-7901细胞的侵袭。3.成功建立胃腺癌SGC-7901细胞系裸鼠皮下肿瘤模型后，每4天测量一次肿瘤体积，并在肿瘤局部多点注射siRNA和Oligofectamine混合物，发现和对照组相比，COX-2siRNA治疗组肿瘤生长缓慢，从治疗后的第15天起，肿瘤体积出现明显差别，这种差别在观察末期(30天)最显著。应用免疫组化法检测肿瘤标本，发现COX-2的蛋白明显敲低的同时，PCNA，CD31，VEGF表达水平均明显降低。应用TUNEL法检测原位细胞凋亡发现COX-2siRNA治疗组凋亡细胞明显增加。体内和体外实验的结果一致。 结论：1.COX-2，PCNA，PGE2，VEGF的表达上调与胃腺癌的分化的严重程度、发生与进展呈正相关。2.应用以Oligofectamine介导的RNA干涉技术转染siRNA靶向COX-2可有效敲低COX-2在胃腺癌SGC-7901细胞内的表达，同时抑制PCNA，PGE2，Bcl-2，CyclinD1与VEGF的表达活性，从而抑制了细胞的增殖和侵袭，出现G0/G1期阻滞，并诱发细胞凋亡。3.裸鼠皮下胃腺癌模型应用Oligofectamine介导的COX-2siRNA治疗，同样可有效敲低COX-2的表达，抑制肿瘤的生长，诱导细胞凋亡，与体外试验结果一致。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

第一部分COX-2在胃腺癌中的异常激活

1.1材料方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

第二部分RNAi抑制COX-2活性对人胃腺癌细胞SGC-7901生长抑制的体外研究

2.1材料方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

第三部分RNAi抑制COX-2活性对SGC-7901人胃腺癌细胞系生长抑制的体内研究

3.1材料方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述RNAi在胃癌相关基因功能研究和治疗方面的应用

致谢