吡那地尔、美托洛尔、谷氨酰胺、胰岛素四药联用对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

摘要

目的：研究吡那地尔（pinacidil，Pin）、美托洛尔（metoprolol，Met）、谷氨酰胺（glutamine，Glu）、胰岛素（insulin，Ins）四药联用对缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）所致大鼠H9c2心肌细胞损伤的保护作用并探讨其作用机制。
　　 方法：将培养的大鼠H9c2心肌细胞随机分为7组，即（1）正常对照（Con）组；（2）缺氧/复氧（H/R）组；（3）吡那地尔（Pin）组；（4）美托洛尔（Met）组；（5）谷氨酰胺（Glu）组；（6）胰岛素（Ins）组；（7）吡那地尔、美托洛尔、谷氨酰胺和胰岛素四药联用（PMGI）组。正常对照组换用无血清的DMEM培养液培养；H/R组缺氧培养180 min，复氧150 min；其余各组则在缺氧前加入相应的药物预处理30 min，Pin、Met、Glu和Ins的终浓度分别为1×10-6 mol/L，2×10-5 mol/L，8x10-3 mol/L，0.01 U/L。测定各组H9c2心肌细胞的存活率；收集培养液测定乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）活性，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；罗丹明123（Rhodamine123，Rh123）荧光探针标记线粒体，检测荧光强度以反映心肌细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，△ψm）变化；流式细胞仪检测心肌细胞凋亡百分率；Western印迹法检测心肌细胞缺氧/复氧损伤保护性蛋白HSP70的表达情况。
　　 结果：
　　 1.细胞存活率：与Con组比较，H/R组的细胞存活率明显减小，从96.0±4.0％降低到48.3.±10.3％（P<0.01）；与H/R组相比，Pin、Met、Glu、Ins、PMGI组的细胞存活率明显升高72.5±5.4％，71.2±5.2％，70.2±5.5％，68.4±10.8％，84.5±5.8％vs48.3.±10.3％（P<0.01），与Con组比较无统计学差异（P>0.05）；与Pin、Met、Glu、Ins组相比，PMGI组的细胞存活率明显升高，P<0.01，与Con组比较无统计学差异（P>0.05）。
　　 2.LDH活性：与Con组比较，H/R组的LDH活性明显升高，从584.1±17.0 U/L升高到834.8±25.4 U/L（P<0.01）；与H/R组相比，Pin、Met、Glu、Ins、PMGI组的LDH活性明显降低637.8±25.4 U/L，656.3±21.8 U/L，667.5±26.5 U/L，703.0±36.6 U/L，597.0±12.7 U/L vs834.8±25.4 U/L（P<0.01），与Con组比较无统计学差异（P>0.05）；与Pin、Met、Glu、Ins组相比，PMGI组的LDH活性明显降低，P<0.01，与Con组比较无统计学差异（P>0.05）。
　　 3.总SOD和Mn-SOD活性：与Con组比较，H/R组的总SOD活性明显降低，从53.44±1.22 U/ml降低到35.90±1.64 U/ml（P<0.01），Mn-SOD活性也明显降低，从20.22±1.47 U/ml降低到12.66±0.54 U/ml（P<0.01）；与H/R组相比，Pin、Met、Glu、Ins、PMGI组的总SOD活性明显升高50.02±3.76 U/ml，44.45±4.83 U/ml，48.38±3.87 U/ml，42.39±2.30 U/ml，53.19±1.57 U/ml vs35.90±1.64 U/ml（P<0.01），Mn-SOD活性明显也升高18.02±2.17 U/ml，15.24±1.87 U/ml，17.34±1.69 U/ml，14.19±1.08 U/ml，19.78±1.49 U/ml vs12.66±0.54 U/ml（P<0.01），与Con组比较无统计学差异（P>0.05）；与Pin、Met、Glu、Ins组相比，PMGI组的总SOD和Mn-SOD活性升高，P<0.05，与Con组比较无统计学差异（P>0.05）。
　　 4.△ψm：与Con组比较，H/R组的细胞线粒体荧光强度明显减小，从248712±12377降低到153851±5498（P<0.01）；与H/R组相比，Pin、Met、Glu、Ins、PMGI组的线粒体荧光强度明显升高190514±10428，160514±7784，166656±6150，169384±7696，224103±11731 vs153851±5498（P<0.05），与Con组比较无统计学差异（P>0.05）；与Pin、Met、Glu、Ins组相比，PMGI组的细胞线粒体荧光强度明显升高，P<0.01，与Con组比较无统计学差异（P>0.05）。
　　 5.细胞凋亡率：与Con组比较，H/R组的细胞凋亡率明显升高，其凋亡率从0.11±0.03％增加到10.95±1.82％（P<0.01）；与H/R组相比，Pin、Met、Glu、Ins、PMGI组的细胞凋亡率明显降低2.85±0.19％，6.83±0.92％，3.47±0.53％，4.90±0.70％，1.44±0.11％vs10.95±1.82％（P<0.01）；与Pin、Met、Glu、Ins组相比，PMGI组的细胞凋亡率明显降低（P<0.05）。
　　 6.热休克蛋白70：与Con组比较，H/R组的HSP70表达明显增多，其条带光密度值从10.2±1.2增加到20.7±2.1（P<0.01）；与H/R组相比，Pin、Met、Glu、Ins、PMGI组的HSP70表达明显升高42.2±4.7，43.2±4.9，56.8±5.2,44.1±3.9，71.7±6.3 vs20.7±2.1（P<0.01）；与Pin、Met、Glu、Ins组相比，PMGI组的HSP70表达明显升高（P<0.01）。
　　 结论：对于缺氧/复氧损伤的大鼠H9c2心肌细胞，吡那地尔、美托洛尔、谷氨酰胺与胰岛素四药联用组与药物单用组相比能明显提高细胞存活率，保护其细胞膜，减少LDH渗漏；增加抗氧化能力，提高SOD含量；提高△ψm；减少细胞凋亡率；增加HSP70的表达。四药联用组与药物单用组相比差别有统计学意义。