血小板微颗粒影响内皮细胞血管内皮生长因子表达及机制

摘要

目的:
　　 检测血小板微颗粒(platelet-derived microparticles,PMPs)诱导后的人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达及其传导通路。研究不同浓度PMPs及与细胞不同作用时间下对内皮细胞释放血管内皮生长因子的差异,探讨PMPs影响内皮细胞VEGF释放的可能机制及其临床意义。
　　 方法:
　　 应用流式细胞术(FCM)从贫血小板血浆(PPP)中提取血小板微颗粒(PMPs),特异性荧光抗体CD61-FITC标记PMPs,上机检测其数量并应用半自动生化分析仪检测血小板微颗粒中蛋白含量。人脐静脉内皮细胞在37℃、5％CO2的条件下常规培养,实验采用3～4代细胞；按1×105/ml密度接种于9.6 cm2的六孔板中,24h后换液,生长接近100％时,即内皮细胞约数为2.5×106时进行PMPs的干预。应用不同干预浓度的PMPs与人脐静脉内皮细胞共培养不同时间,每一组4个样本,分别在干预2小时、4小时、24小时后收集内皮细胞,应用半定量逆转录聚合酶链式反应技术测定内皮细胞VEGF、VEGF受体Flt/KDR、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)以及胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,EgK)的表达水平。
　　 结果:
　　 应用流式细胞术(FCM),经过二磷酸腺苷(ADP)激活血小板,可以从贫血小板血浆(PPP)中提取并检测到高纯度的血小板微颗粒。不同干预浓度的PMPs与人脐静脉内皮细胞共培养不同时间后,半定量逆转录聚合酶链式反应技术测定mRNA表达,VEGF mRNA的表达水平在对照组(PMPs未干预组)显著高于PMPs干预浓度为10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml组(P<0.05),与之相反,KDR mRNA表达水平在对照组显著低于四组不同浓度PMPs组mRNA表达水平(P<0.05)。ERKmRNA表达水平在PMPs50μg/ml组显著高于对照组(P<0.05),P13KmRNA表达水平在PMPs100μg/ml组显著高于对照组(P<0.05)。PMPs干预细胞不同时间,VEGF mRNA的表达水平在对照组显著高于PMPs干预24小时组(P<0.05),KDRmRNA的表达水平在对照组显著低于PMPs干预4小时、24小时组(P<0.05),PI3KmRNA表达水平在PMPs干预24小时组显著高于对照组(P<0.05)。
　　 结论:
　　 贫血小板血浆法血小板经ADP激活,可使其释放大量PMPs。PMPs干预内皮细胞后,PMPs被激活,可能释放大量的VEGF,使得内皮细胞自身的VEGFmRNA表达受到负反馈抑制而减少,而内皮细胞VEGF受体2即KDRmRNA表达明显增加,其下游信号转导通路中的两个关键酶PDK及ERKmRNA表达也明显升高,即PMPs可能通过PI3K/Akt及MAPK/ERK等信号转导途径参与以血管和血管发生为基础的生物学过程,促进内皮细胞、平滑肌细胞等的增殖,抑制其调亡,于冠心病患者缺血心肌新生血管的形成及冠状动脉粥样硬化斑块的形成等具有重要意义。