线形程序性坏死与肿瘤微血管构筑的相关性及临床意义研究

摘要

目的：
　　 1.通过检测人体恶性黑色素瘤组织中线形程序性坏死的形态学特征及分布特点，探讨线形程序性坏死与恶性黑色素瘤多个临床病理学参数之间的相关关系，阐明线形程序性坏死对恶性黑色素瘤生物学行为的影响及其作用，并探讨其临床病理意义。
　　 2.利用计算机软件系统，分别从二维向量和三维重建角度分析同一组织区域内线形程序性坏死和肿瘤新生微血管网的分布、走行及空间构造形式，探讨线形程序性坏死与肿瘤微血管的空间排布之间的关系；通过检测血管生成相关因子VEGF等在恶性黑色素瘤组织中的表达，分析其与线形程序性坏死的相关性，进一步从机制方面探讨线形程序性坏死在恶性黑色素瘤新生微血管构筑中的作用和意义。
　　 3.通过检测凋亡和自噬相关蛋白在恶性黑色素瘤中的表达情况，分析调控程序性死亡的相关蛋白在线形程序性坏死形成中的作用和意义，探讨线形程序性坏死形成的分子机制。
　　 方法：
　　 1.应用组织病理学方法观察70例人体恶性黑色素瘤组织中线形程序性坏死的形态学特征、分布特点以及恶性黑色素瘤组织的一般组织病理学特征，对线形程序性坏死与恶性黑色素瘤临床病理参数之间的相关关系进行统计学分析。
　　 2.应用免疫组织化学染色方法分别检测缺氧诱导因子HIF-1α、Ki67及血管生成相关因子VEGF及其受体、凋亡和自噬相关蛋白AIF、Beclin-1和LC3等在恶性黑色素瘤中的表达，分析这些蛋白在线形程序性坏死阳性组与阴性组表达的差异性。应用CD31免疫组织化学染色和PAS组织化学双重染色检测恶性黑色素瘤中新生微血管密度及血管生成拟态的分布情况，分析二者与线形程序性坏死的相关性及其对线形程序性坏死的影响和意义。
　　 3.采用Real time PCR实时定量方法检测恶性黑色素瘤组织中血管生成相关因子VEGF及其受体等以及凋亡、自噬相关蛋白AIF、Beclin-1和LC3等的mRNA表达水平。分析这些因子的mRNA在线形程序性坏死阳性组与阴性组表达的差异性，分析这些因子的mRNA表达与线形程序性坏死的相关关系及意义。
　　 4.应用组织微阵列的方法进行肿瘤组织连续切片，再行CD31免疫组化染色后，应用计算机图像采集系统采集免疫组化染色图像，用于后续计算机软件分析。
　　 5.应用计算机软件分析系统，分别从二维向量和三维重建角度分析相同区域内的肿瘤组织中线形程序性坏死与肿瘤微血管网的分布、走行及空间构造形式的相似性。
　　 结果：
　　 1.70例恶性黑色素瘤组织中，线形程序性坏死阳性者占54.29％，血管生成拟态阳性者占44.3％，二者的表达呈密切相关(rs=0.529，p=0.000)。
　　 2.线形程序性坏死的出现与多种临床病理参数密切相关。如与溃疡(rs=0.350，p=0.003)、Breslow’s厚度(rs=0.287，p=0.016)、组织学亚型(rs=0.261，p=0.029)、远处转移(rs=0.326，p=0.006)、核分裂指数(rs=0.668，p=0.000)、Ki67指数(rs=0.703，p=0.000)及等呈正相关，与肿瘤色素形成呈负相关(rs=-0.375，p=0.001)。而与患者年龄、性别、淋巴结侵犯、远处转移、AJCC分期、细胞表型、间质反应以及有无核仁等无关(p>0.05)。
　　 3.Kaplan-Meier和Log rank test生存分析结果显示，存在线形程序性坏死的患者术后总生存时间和无转移生存时间明显低于不存在LPPCN者，差异有统计学意义(p=0.005)，但是Cox Regression多因素生存分析中，线形程序性坏死未显示出预后意义(p>0.05)。
　　 4.相同组织区域范围内线形程序性坏死细胞与微血管分布的向量分析及三维重建图像显示线形程序性坏死细胞与肿瘤新生微血管的分布和走行趋势及空间构造趋于一致。
　　 5.免疫组化染色及Real time PCR实时定量检测结果显示HIF-1α、FLK-1及VEGF的蛋白及mRNA在恶性黑色素瘤组织中均有较高水平的表达，并且在线形程序性坏死阳性组的肿瘤中的表达水平明显高于线形程序性坏死阴性组，差别有统计学意义(p<0.05)。
　　 6.免疫组化染色及Real time PCR实时定量检测结果显示Beclin-1、Atg4B、LC-3、细胞色素C和AIF蛋白及mRNA在恶性黑色素瘤中均有较高水平的表达，在线形程序性坏死阳性组的肿瘤中的表达明显高于线形程序性坏死阴性组，差别有统计学意义(p<0.05)。
　　 结论：
　　 1.绝大多数高侵袭性恶性黑色素瘤组织中存在线形程序性坏死。
　　 2.线形程序性坏死与肿瘤的增殖、浸润和转移等生物学特性相关。线形程序性坏死的出现提示患者预后不良。
　　 3.线形程序性坏死是恶性黑色素瘤中微血管构筑的早期事件，线形程序性坏死可能为微血管构筑提供空间基础。
　　 4.线形程序性坏死是肿瘤群体在缺氧微环境下自身调节的适应性改变。凋亡及自噬相关蛋白在线形程序性坏死形成的分子机制中起到重要的调节作用。