gp96-肽复合物冲击DC转化T淋巴细胞为CTL杀伤自体外周血循环肿瘤细胞的初步探讨

摘要

实验目的：
　　 通过提取肾腺癌患者(透明细胞癌Ⅱ级及以上的)自体肿瘤组织中的gp96-肽复合物作为抗肿瘤免疫反应的启动因子，致敏患者自体树突状细胞转化自体T淋巴细胞为细胞毒T淋巴细胞，杀伤自体肿瘤患者的外周血循环肿瘤细胞。
　　 实验内容：
　　 本课题由两部分组成：本文第一部分通过组织匀浆及硫酸铵分级盐析后，经BIO-RAD duoflow蛋白纯化系统纯化gp96-肽复合物备用。第二部分主要是先确定肾腺癌患者外周血中是否含有循环肿瘤细胞，而经确认有循环肿瘤细胞后分离患者外周血循环肿瘤细胞，并培养相对应的自体淋巴细胞和树突状细胞，加入gp96-肽复合物后，促进DC细胞成熟。按大约1:20的比例将致敏的DC与自身分离的T淋巴细胞培养72小时，再与循环肿瘤细胞共培养，显微镜观察杀伤循环肿瘤细胞的情况，并检测T淋巴细胞的细胞因子IFN-γ分泌情况以及对循环肿瘤细胞的杀伤活性。
　　 本文所采用的分离循环肿瘤细胞的方法经过验证对患者是没有任何影响，简单，快速的可以获得不同数量的活循环肿瘤细胞，同时也可以避免有些肿瘤患者循环肿瘤细胞数量稀少和组织来源的限制。
　　 实验方法：
　　 1.共选取30例病理确诊为肾腺癌(透明细胞癌Ⅱ级及以上)的患者，在术中保留其肿瘤组织，通过组织匀浆及硫酸铵分级盐析后，用BIO-RAD duoflow蛋白纯化系统经ConA亲和层析和DEAE离子层析纯化gp96-肽复合物，利用SDS-PAGE和Western-blotting技术对其进行鉴定并应用BCA法测定浓度。
　　 2.在术后一周后抽取对应患者外周血10ml梯度密度离心后，经细胞涂片和单个核细胞的贴壁培养，确认是否含有循环肿瘤细胞。
　　 3.确认有循环肿瘤细胞的患者，通过COBE spectraTM血细胞分离仪分离其外周血中的单个核细胞。
　　 4.分离外周血单个核细胞后，分别培养树突状细胞和T淋巴细胞，并在第7天加入纯化的gp96-肽复合物，再与分离培养的循环肿瘤细胞共培养。
　　 5.检测T淋巴细胞细胞因子IFN-γ的分泌情况及对循环肿瘤细胞的杀伤活性。
　　 实验结果：
　　 1.经SDS-PAGE和Western-blotting技术鉴定从。肾细胞癌组织中纯化出的蛋白为gp96-肽复合物。
　　 2.通过HE染色和单个核细胞培养后显微镜确认分离出的循环肿瘤细胞，结果发现20例患者外周血中含有循环肿瘤细胞。
　　 3.每天倒置显微镜下观察淋巴细胞和树突状细胞生长状态良好；个别循环肿瘤细胞贴壁生长且发生了核分裂。
　　 4.共培养后倒置显微镜下观察杀伤实验结果，可见绝大部分肾腺癌患者(透明细胞癌Ⅱ级及以上的患者)循环肿瘤细胞被淋巴细胞所包围，并发生崩解，细胞因子IFN-γ检测和杀伤活性检测表明此方法行之有效。
　　 实验结论：
　　 1.通过硫酸铵分级盐析和BIO-RAD duoflow蛋白纯化系统可以从肾腺癌组织中纯化出gp96-肽复合物。
　　 2.抽取肾腺癌患者外周血10ml梯度密度离心后，细胞涂片及贴壁培养后可以找到循环肿瘤细胞。
　　 3.通过自体gp96-肽复合物诱导可以致敏自体DC转化自体T淋巴细胞为细胞毒T淋巴细胞杀伤肾腺癌患者外周血循环肿瘤细胞成功。